【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种酶切反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签及其应用。
技术介绍
1、继单细胞组学技术热潮的掀起，近年来涌现出大量空间组学成像技术，如空间转录组、空间蛋白组、空间代谢组、空间表观组等等，相继被nature methods评为2020年度技术、被nature评为2022年7大“颠覆性”技术之一。空间技术的火热程度反映出在生命科学研究中空间位置信息的重要性和必要性，其中，蛋白质是生命活动的直接执行者，在空间层面对蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。目前针对蛋白组开发的空间检测技术众多，根据检测手段的不同可以分为三大类：基于荧光成像的空间蛋白组技术、基于质谱的空间蛋白组技术以及基于测序的空间蛋白组技术。
2、在基于荧光成像的空间蛋白组技术中，比较有代表性的当属美国akoya公司开发的codex(co-detection by indexing)单细胞蛋白组学分析平台1。codex的核心设计包含两个部分：其一是靶向试剂，由标记特异性寡核苷酸标签序列(barcode)的一抗组成；其二是成像试剂，是与barcode互补的荧光探针。其样本前处理步骤同普通免疫荧光，区别在于抗体孵育使用barcode-抗体与靶标蛋白特异性结合，然后加入成像试剂，目的是使荧光探针与barcode-抗体-靶标蛋白特异性杂交，通过荧光成像分析靶标蛋白的空间分布及相对丰度。其中，成像试剂分批次加入，每次加入3种带有不同颜色的探针，成像之后，在温和条件下洗脱荧光标记物，完成一个
3、基于质谱的空间蛋白组技术利用偶联在抗体上的金属标签做作为检测信号，金属标签通过质谱仪进行分辨，后者能区分相差仅1da差别的金属元素，因此金属标签不存在类似于荧光标签的光谱2重叠困扰。多路离子束成像技术mibi(multiplexed ion beamimaging)3和组织质谱成像技术imc(imaging mass cytometry)4是两种典型的基于质谱的空间蛋白组技术。与荧光成像技术不同，质谱成像技术使用金属同位素标记一抗，待标记的一抗与组织孵育结合后，使用激光(imc)或离子光束(mibi)释放抗体结合的同位素，然后通过质谱对同位素分子定性定量，最后，将检测结果与单细胞分辨率图像合并，以获得空间蛋白表达谱。由于质谱检测器的质量分辨率允许检测几十种金属标签而不受干扰，所以质谱成像可以同时检测多达40种靶标蛋白，但由于金属同位素标记成本较高，仪器贵重，限制了质谱成像技术的广泛应用。
4、美国nanostring公司在2018年发布的数字空间分析平台geomx dsp(digitalspatial profiler)，简称dsp，是典型的基于测序的空间蛋白组技术5。与codex相同，dsp也对每个抗体添加了特异性寡核苷酸标签，不同的是dsp无需荧光探针循环成像，而是通过紫外光释放标记在抗体上的特异性寡核苷酸标签序列，收集标签通过ngs测序或ncounter读数定量。dsp的核心优势在于利用dna序列进行编码，dna标签具备的丰富的核酸序列信息使得其可以编码相当可观的蛋白数量，理论上编码数量无上限。不仅如此，dsp还兼容转录组分析，可以从转录组和蛋白两个层面解析组织空间异质性。然而其检测过程涉及复杂的标签定位和测序技术，难度大、耗时长且成本高。此外，虽然工作流程很大程度上是自动化的，但手动选择roi却使分析整个组织切片的难度增加。
5、尽管上述技术对于少量的、几十种蛋白的共成像已经达到较好的效果，其相对于生物样本中近两万种蛋白的蛋白组库而言，成像数量甚少，亟待一种可大幅度提升蛋白成像数量的工具。此外，近些年发展的基于质谱或者测序的成像技术涉及到许多大型仪器设备、操作复杂，难以在普通实验室推广。因此，当前该领域亟需开发一种可以在普通实验室推广使用的超高维度蛋白成像技术。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种可以在普通实验室广泛推广使用的超高维度蛋白成像技术以及实现该技术的成像标签。
2、本专利技术提供一种限制性内切酶介导的时序性编码的高维度成像标签，所述时序性荧光编码的高维度成像标签为包括带有荧光/淬灭基团和限制性内切酶酶切位点的dna链组合。
3、所述时序性荧光编码的高维度成像标签通过不同的限制性内切酶对dna的特异性识别切割反应来切换颜色。本专利技术所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签即限制性内切酶介导dna切割标签(restriction endonuclease mediated dnacutting)，简称redc barcode。为了使超高维度蛋白成像技术能在普通实验室推广使用，本专利技术采取了广泛使用的荧光团作为检测标签。为了使有限的荧光团能标记无限多的蛋白，本专利技术设计了一种随时间变化发生不同颜色切换的荧光颜色，不同“荧光颜色”与“出现时序”的排列组合将产生海量的荧光编码(如图1所示)。
4、如图2所示，所述时序性变化荧光串可与抗体、多肽、适配体、荧光原位杂交探针等多种靶向试剂偶联，靶向特定蛋白或核酸，使得不同靶标在不同成像轮数中依次发出各自预设顺序的光，通过荧光显微镜拍摄并记录下各自信息，最后即可根据获得的荧光串信息反推出对应的靶标。假设共有f种不同颜色的荧光团参与成像，t次时序变化则可以有ft种不同的编码。这种指数型编码方式是一种可以极大提升靶标成像数量的方式，若有5种荧光参与编码，最多只需6个时间序列，即可编码56＝15625种蛋白，几乎涵盖蛋白组学水平所有蛋白。
5、本专利技术提供一种限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由dna链组成，所述dna组装体上间隔设置有不同的荧光基团，从第2个荧光基团起，每个荧光基团相邻设计了淬灭基团致使其不发光，因此组装体在初始状态下只发射属于第1个荧光基团的光。每组相邻的荧光-淬灭基团之前设有dna限制性内切酶的识别位点，当酶切发生之后，前1个荧光基团因被切开而释放，后一个荧光基团因其邻近淬灭基团由于低tm值导致的解离而发光；反应依次进行，则可以发生一系列的颜色变化。基于此，研究者们只需在dna链上设计不同荧光-淬灭基团的排列组合，依次按照顺序加入不同的内切酶，切断不同的酶切位点，即可以让dna链按照不同的顺序发出不同的荧光。形成限制性内切酶介导的时序性变化荧光编码。优选地，所述荧光基团的个数为1-6个，例如1个、2个、3个、4个、5个；更优选为3-5个。
6、在一种具体的实施方式中，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由n条dna链组装而成，所述dna链上设置荧光基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述时序性荧光编码的高维度成像标签为包括带有荧光/淬灭基团和限制性内切酶酶切位点的DNA链组合。
2.如权利要求1所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由DNA链组装而成，所述DNA链组装体上间隔设置有不同的荧光基团，从第2个荧光基团起，每个荧光基团相邻设计了淬灭基团致使其不发光，组装体在初始状态下只发射属于第1个荧光基团的光；每组相邻的荧光-淬灭基团之前(左侧)设有不同的限制性内切酶酶切位点，当特定位点的酶切发生之后，前1个荧光基团因被切开而消失，后一个荧光基团因其邻近淬灭基团由于低Tm值导致的解离而发光；所述荧光基团的个数为1-6个。
3.如权利要求1所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由n条DNA链组装而成，所述DNA链上设置荧光基团和淬灭基团，每一对相互作用的荧光基团和淬灭基团分别被修饰在了两条链上，当二者同时杂交到第三条链之后，荧光基团会被淬灭基团所
4.如权利要求1～3任一项所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，
5.如权利要求1-4任一项所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述荧光编码随加入不同的限制性内切酶时间的变化发生不同颜色切换的荧光颜色，不同“荧光颜色”与“出现时序”的排列组合将产生海量的荧光编码。
6.根据权利要求1-5任一项所述时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述标签为一组探针组合物，所述探针组合物包括限制性内切酶荧光探针、限制性内切酶淬灭探针、限制性内切酶互补探针；所述限制性内切酶淬灭探针与限制性内切酶荧光探针串联，并与限制性内切酶互补探针杂交；所述限制性内切酶荧光探针和/或限制性内切酶淬灭探针上设计有限制性内切酶的酶切位点；优选地，所述限制性内切酶荧光链为n-1条。
7.根据权利要求6所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述探针组合物为一套基于Cviqi内切酶识别的探针组合，所述探针序列包括Cviqi-荧光探针、Cviqi-淬灭探针和Cviqi-互补探针，所述探针组合的核酸序列从5’至3’方向的顺序依次是：
8.根据权利要求6所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述探针组合物为一套基于Swai内切酶识别的探针组合，所述探针序列包括Swai-荧光探针、Swai-淬灭探针和Swai-互补探针，所述探针组合的核酸序列从5’至3’方向的顺序依次是：
9.根据权利要求6所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述探针组合物为一套基于Cviqi和Swai内切酶顺序识别的探针组合，所述探针序列包括荧光链1(Fluorescence 1，F1)、荧光链2(Fluorescence 2，F2)、荧光链3(Fluorescence1，F3)和互补链(Complementation，C)，所述探针组合的核酸序列从5’至3’方向的顺序依次是：
10.如权利要求1-6任一项所述的限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签或权利要求7-9任一项所述的探针组合，在空间蛋白成像技术中的应用，尤其在超高维度蛋白成像技术中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述时序性荧光编码的高维度成像标签为包括带有荧光/淬灭基团和限制性内切酶酶切位点的dna链组合。
2.如权利要求1所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由dna链组装而成，所述dna链组装体上间隔设置有不同的荧光基团，从第2个荧光基团起，每个荧光基团相邻设计了淬灭基团致使其不发光，组装体在初始状态下只发射属于第1个荧光基团的光；每组相邻的荧光-淬灭基团之前(左侧)设有不同的限制性内切酶酶切位点，当特定位点的酶切发生之后，前1个荧光基团因被切开而消失，后一个荧光基团因其邻近淬灭基团由于低tm值导致的解离而发光；所述荧光基团的个数为1-6个。
3.如权利要求1所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述限制性内切酶介导的时序性荧光编码的高维度成像标签由n条dna链组装而成，所述dna链上设置荧光基团和淬灭基团，每一对相互作用的荧光基团和淬灭基团分别被修饰在了两条链上，当二者同时杂交到第三条链之后，荧光基团会被淬灭基团所淬灭；
4.如权利要求1～3任一项所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，
5.如权利要求1-4任一项所述的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述荧光编码随加入不同的限制性内切酶时间的变化发生不同颜色切换的荧光颜色，不同“荧光颜色”与“出现时序”的排列组合将产生海量的荧光编码。
6.根据权利要求1-5任一项所述时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述标签为一组探针组合物，...
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