【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体及其制备、应用。
技术介绍
1、单链抗体(single chain antibody fragment，scfv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scfv能较好地保留其对抗原的亲和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点，所以其优点表现为可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性；渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度；免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。在抗病毒、肿瘤治疗、自身免疫病治疗，靶向药物治疗等等方面具有广泛的应用前景。
2、单链抗体的制备主要通过基因工程技术进行人工合成，且在原核与真核表达系统中均能完成。
3、但是由于胞内的加工与修饰导致表达的蛋白电荷异构体复杂多样，所以体现出其纯度低，单一性差的特点，并直接导致蛋白的稳定性差，易降解，亲和力不足，不利于后期保存运用。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体及其制备、应用，可以有效解决上述问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、本专利技术实施例提供一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
4、s1，合成25-oh-vd3-scfv单链抗体序列，然后插入至ptt5载体中，并转
5、s2，将所述细胞培养物上清液用ni sepharose excel填料进行目的蛋白的富集，获取洗脱组分；
6、s3，将所述洗脱组分采用nuvia hp q阴离子交换填料进行分离纯化，获取穿透组分；
7、s4，将所述穿透组分的ph调节至6.0±0.5，再用缓冲液及氯化钠溶液将所述穿透组分的电导率调节至12.0±1.0ms/cm；
8、s5，采用capto spimpres阳离子交换填料进行线性梯度洗脱40个柱床体积，然后对梯度内的不同峰进行分类收集，得到抗25-oh维生素d3的重组单链抗体。
9、本专利技术还进一步提供一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体，所述抗25-oh维生素d3的重组单链抗体为根据上述的方法获得。
10、本专利技术还进一步提供一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体，所述抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11、本专利技术还进一步提供一种上述的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体在抗25-oh维生素d3检测方面的应用。
12、本专利技术的有益效果是：本专利技术使用镍离子亲和层析和阴离子交换层析对单链抗体进行富集初纯，从而可以制备得纯度不低于95％的单链抗体。随后再通过强阳离子交换层析对电荷异构体进行精纯，去除稳定性差、亲和力低的电荷异构体成分，从而最终制备得高稳定、高亲和力的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体。本专利技术提供的单链抗体序列，可高效、特异结合25-oh vd3，可用于25-oh vd3的检测方法学开发。
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1.一种抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述合成25-OH-VD3-scFv单链抗体序列，然后插入至PTT5载体中，并转染含单链抗体序列的PTT5载体至HEK293细胞中的步骤包括：
3.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述将所述细胞培养物上清液用Ni Sepharose Excel填料进行目的蛋白的富集获取洗脱组分的步骤包括：
4.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述将所述洗脱组分采用Nuvia HP Q阴离子交换填料进行分离纯化获取穿透组分的步骤包括：
5.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述将所述穿透组分的pH值由3.5调节至6.0±0.5，再用缓冲液及氯化钠溶液将所述穿透组分的电导率调节至12.0±1.0mS/
6.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，所述采用Capto SPImpRes阳离子交换填料进行线性梯度洗脱40个柱床体积的步骤包括：
7.如权利要求1所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，所述对梯度内的不同洗脱峰进行分类收集的步骤包括：
8.一种抗25-OH维生素D3的重组单链抗体，其特征在于，所述抗25-OH维生素D3的重组单链抗体为根据权利要求1-6任一项所述的方法获得。
9.一种抗25-OH维生素D3的重组单链抗体，其特征在于，所述抗25-OH维生素D3的重组单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
10.一种如权利要求7或8所述的抗25-OH维生素D3的重组单链抗体在抗25-OH维生素D3检测方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述合成25-oh-vd3-scfv单链抗体序列，然后插入至ptt5载体中，并转染含单链抗体序列的ptt5载体至hek293细胞中的步骤包括：
3.如权利要求1所述的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤s2中，所述将所述细胞培养物上清液用ni sepharose excel填料进行目的蛋白的富集获取洗脱组分的步骤包括：
4.如权利要求1所述的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤s3中，所述将所述洗脱组分采用nuvia hp q阴离子交换填料进行分离纯化获取穿透组分的步骤包括：
5.如权利要求1所述的抗25-oh维生素d3的重组单链抗体的制备方法，其特征在于，在步骤s4中，所述将所述穿透组分的ph值由3.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈杰鹏，张娇，黄奋飞，杨萍萍，江荣成，范进华，林榕榕，杨志伟，周斌，章永垒，
申请(专利权)人：厦门康基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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