【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及一种复合纳米粒子、胰岛素示踪方法及其应用，具体来说，本专利技术构建了一种能够特异性结合胰岛素的纳米材料以及利用该纳米材料进行胰岛素示踪的方法，并涉及小鼠胰岛细胞的分离，体外培养及高效的体内移植技术。利用该示踪技术能实时监测小鼠体内胰岛素浓度。
技术介绍
1、胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。胰岛素分泌过多时，血糖下降迅速，脑组织受影响最大，可出现惊厥、昏迷，甚至胰岛素休克。相反，胰岛素分泌不足或胰岛素受体缺乏常导致血糖升高，若超过肾糖阈，则糖从尿中排出，引起糖尿，同时，血液成份含有过量的葡萄糖，亦会导致高血压、冠心病和视网膜血管病等病变。糖尿病患者血糖升高的主要原因是胰岛素的绝对或相对不足，因此实时监测体内胰岛素浓度变化，可进一步了解胰岛β细胞的功能，对糖尿病的诊断、治疗及预后都有着重要的意义。
2、胰岛细胞移植技术是目前备受关注的治疗糖尿病的手段之一，但移植后的胰岛细胞常常因细胞凋亡或坏死而丧失分泌胰岛素的功能，目前医学上监测胰岛素浓度最为常用的方法是放射免疫分析(r1a)，但是，放射免疫分析存在以下问题：（1）测定过程会使用生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性；（2）方法本身的工作原理限制了检测胰岛素的灵敏度，即不能测定特别低含量的胰岛素；（
3、因此迫切需要一种受周围环境影响小、稳定性高、可以实时进行胰岛素监测，并能用于体内胰岛素浓度的检测的方法。
技术实现思路
1、近年来，上转换纳米粒子（ucnps）在生物传感领域展现出广阔的前景，ucnps具有粒径小、形状可调、稳定性高、发射带宽窄、荧光寿命长、发射范围广、生物相容性好、表面易修饰等优点。小粒径、强荧光发射的ucnps经过表面修饰后，可以作为一类多功能的复合纳米粒子，在生物医学等领域发挥着重要作用。本专利技术提供了一种监测体内胰岛素的复合纳米材料及其在胰岛素示踪方面的应用，该复合纳米材料由上转换纳米粒子、猝灭剂和抗体组成。具体为合成能特异性结合胰岛素的复合纳米材料，将复合纳米材料与分离纯化、过夜培养后的小鼠胰岛细胞进行共孵育，随后将共孵育后的小鼠胰岛细胞移植入小鼠体内，进入小鼠体内的复合纳米材料能与小鼠分泌的胰岛素相结合，实现体内胰岛素浓度的实时监测。
2、为此，本专利技术第一方面提供一种复合纳米粒子，包括：上转换纳米粒子、胰岛素抗体和猝灭剂，其中，所述胰岛素抗体搭载于所述上转换纳米粒子与所述猝灭剂之间。
3、本专利技术的复合纳米粒子能够特异性结合胰岛素，可以有效地对不同液体环境中存在的胰岛素进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，在培养具有胰岛素分泌功能的类器官中，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化监测。
4、根据本专利技术的具体实施方案，当体内含有胰岛素时，胰岛素能与ucnps-ab通过抗原抗体相互作用结合在一起，导致ucnps-ab与猝灭剂距离被拉长，受激光激发的ucnps不能将能量传递给猝灭剂，使得上转换纳米粒子本身的红色荧光强度恢复，在含有不同浓度的胰岛素的环境中，上转换纳米粒子恢复的荧光强度不同。
5、根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的复合纳米粒子与胰岛细胞共孵育后，可以进入到胰岛细胞中，在胰岛细胞移植技术中，可以实时监测胰岛细胞分泌胰岛素的状态、检测分泌的胰岛素的浓度，可以作为胰岛细胞移植的伴随诊断方法，在短时间内预测胰岛细胞移植技术治疗糖尿病的效果。
6、根据本专利技术的具体实施方案，所述复合纳米粒子进一步包括聚乙烯亚胺。
7、根据本专利技术的具体实施方案，所述聚乙烯亚胺附着于所述上转换纳米粒子的外表面，所述胰岛素抗体通过与所述聚乙烯亚胺共价相连搭载于所述上转换纳米粒子的外表面，所述聚乙酰亚胺为述胰岛素抗体搭载于所述上转换纳米粒子提供连接位点。
8、根据本专利技术的具体实施方案，所述猝灭剂通过共价键与所述胰岛素抗体连接。
9、根据本专利技术的具体实施方案，所述猝灭剂能猝灭所述上转换纳米粒子发出的光。
10、根据本专利技术的具体实施方案，所述猝灭剂包括孟加拉红溴己酸、黑洞猝灭剂-2、tq3琥珀酰亚胺酯中的任意一种。
11、需要说明的是，只要是吸收波长在550 nm左右的的淬灭剂均适用于本专利技术，比如黑洞猝灭剂-2（bhq-2），一种黑洞猝灭荧光染料，它的吸收波长在579nm和550-650nm之间，常与在可见光557-617nm范围内发出橘黄色荧光的染料配合使用，可以有效地抑制该染料发光；tq3琥珀酰亚胺酯（tide quencher 3），一种被设计用于tamra、tf3和cy3的荧光淬灭剂。它的吸收波长为576nm，发射波长为n/a，分子量为550.59。
12、根据本专利技术的具体实施方案，所述孟加拉红溴己酸（rbha）由孟加拉红与溴己酸反应获得的。
13、根据本专利技术的具体实施方案，所述上转换纳米粒子包括核层、壳层，所述壳层包裹所述核层。
14、根据本专利技术的具体实施方案，所述核层包括nayf4:yb3+/er3+，所述壳层包括nayf4。
15、根据本专利技术的具体实施方案，所述上转换纳米粒子在可见光照射下可发出红色荧光，当所述可见光波长为645nm~665nm出时现红色荧光发射峰，其中荧光强度灵敏度较高，减少周围环境的影响后，可显著提高检测胰岛素的灵敏度，稳定、有效的利用荧光强度获得胰岛素浓度。
16、根据本专利技术的实施例，上述上转换纳米粒子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
17、根据本专利技术的具体实施方案，所述核层的粒径为22-28nm，优选为25nm。
18、根据本专利技术的具体实施方案，所述壳层的粒径为32-38nm，优选为35nm。
19、根据本专利技术的具体实施方案，所述y3+是以ycl3·6h2o的形式提供的，所述yb3+是以ybcl3·6h2o的形式提供的，所述er3+是以ercl3·6h2o的形式提供的。根据本专利技术实施例的形式提供y3+、yb3+和er3+制备得到的上转换纳米粒子具有很好的发光效果。
20、根据本专利技术的具体实施方案，所述核层中y3+、yb3+、er3+的摩尔比为（78-82）：（16-20）：（1-2）。
21、根据本专利技术的具体实施方案，所述核层中y3+、yb3+、er3+的摩尔比为40：9：1。
22、本专利技术第二方面提供一种制备第一方面所述复合纳米粒子的方法，包括：
23、1）将所述上转换纳米粒子与所述聚乙烯亚胺在溶液1中混合，获得上转换纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种复合纳米粒子，其特征在于，包括：上转换纳米粒子、胰岛素抗体和猝灭剂，
2.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述复合纳米粒子进一步包括聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求2所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述聚乙烯亚胺附着于所述上转换纳米粒子的外表面，所述胰岛素抗体与所述聚乙烯亚胺共价相连。
4.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂通过共价键与所述胰岛素抗体连接。
5.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂能猝灭所述上转换纳米粒子发出的光。
6.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂包括孟加拉红溴己酸、黑洞猝灭剂-2、TQ3琥珀酰亚胺酯中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述上转换纳米粒子包括核层、壳层，所述壳层包裹所述核层。
8.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层包括NaYF4:Yb3+/Er3+，所述壳层包括NaYF4。
9.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特
10.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为40：9：1。
11.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层的粒径为22-28nm。
12.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述壳层的粒径为32-38nm。
13.一种制备权利要求1-12任一项所述复合纳米粒子的方法，其特征在于，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，活化所述胰岛素抗体的方法包括：将所述胰岛素抗体与交联剂1混合孵育。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述交联剂1选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，活化所述猝灭剂的方法包括：将所述猝灭剂与交联剂2混合孵育。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述交联剂2选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（5-8）：（400-600）。
19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（6.5-7.5）：（450-550）。
20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述猝灭剂与所述上转换纳米粒子-抗体在共孵育体系中的摩尔比为1：（7-20）。
21.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述猝灭剂与所述上转换纳米粒子-抗体在共孵育体系中的摩尔比为1：（10-18）。
22.权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子在检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况的试剂盒中的应用。
23.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子，所述试剂盒用于检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况。
24.权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子在检测和/或监测具有胰岛素分泌功能的类器官中的应用。
25.一种检测胰岛素的方法，其特征在于，包括：
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括具有胰岛素分泌功能的类器官样本、组织样本或细胞样本。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述激发光的波长为950-1000nm。
28.一种监测胰岛素分泌状况的方法，其特征在于，包括：
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤A中，共孵育之前，用链脲佐菌素处理所述体外胰岛细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述体外胰岛细胞源自鼠源胰岛细胞或灵长目源胰岛细胞。
31.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述受施体包括小鼠、羊、骆驼、马、猴中的任意之一。
32.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述补充营养物质的方法包括注射葡萄糖、喂食可代谢为糖类的食品。
33.根据...
【技术特征摘要】
1.一种复合纳米粒子，其特征在于，包括：上转换纳米粒子、胰岛素抗体和猝灭剂，
2.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述复合纳米粒子进一步包括聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求2所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述聚乙烯亚胺附着于所述上转换纳米粒子的外表面，所述胰岛素抗体与所述聚乙烯亚胺共价相连。
4.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂通过共价键与所述胰岛素抗体连接。
5.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂能猝灭所述上转换纳米粒子发出的光。
6.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂包括孟加拉红溴己酸、黑洞猝灭剂-2、tq3琥珀酰亚胺酯中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述上转换纳米粒子包括核层、壳层，所述壳层包裹所述核层。
8.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层包括nayf4:yb3+/er3+，所述壳层包括nayf4。
9.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层中y3+、yb3+、er3+的摩尔比为（78-82）：（16-20）：（1-2）。
10.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层中y3+、yb3+、er3+的摩尔比为40：9：1。
11.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层的粒径为22-28nm。
12.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述壳层的粒径为32-38nm。
13.一种制备权利要求1-12任一项所述复合纳米粒子的方法，其特征在于，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，活化所述胰岛素抗体的方法包括：将所述胰岛素抗体与交联剂1混合孵育。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述交联剂1选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，活化所述猝灭剂的方法包括：将所述猝灭剂与交联剂2混合孵育。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述交联剂2选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵冰，代权辉，魏劲松，
申请(专利权)人：山东伯桢生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。