【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为一种羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1的鉴定和应用。
技术介绍
1、人卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,ivm)是一项辅助生殖技术，旨在将从有腔卵泡中收集的未成熟卵丘-卵母细胞复合体通过体外培养来获得成熟的卵母细胞。尽管ivm已经在临床中实践了几十年，但是目前其在临床实践中的应用仍然有限。其主要原因还是在于卵子的体外培养不能完全模拟体内成熟的环境，未成熟卵母细胞体外培养后的卵子成熟率不高，发育潜力差。因此，还需要更多深入的研究来进一步提高未成熟卵母细胞的体外成熟率，从而提高卵子利用率，进而提高妊娠率。
2、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)已被证明能够分泌多种自分泌/旁分泌因子，包括生长因子和细胞因子，这些因子在细胞的生长发育过程中起很大作用。人羊膜是羊膜间充质干细胞(hamscs)的重要来源，它有抗炎、抗菌、抗血管生成特性和低免疫原性等优点。hamsc分泌因子已用于急性脑损伤的无细胞治疗。我们在hamscs条件培养基(hamscs-cm)中发现了许多与细胞增殖有关的蛋白质。
3、血小板反应蛋白1(thrombospondin 1，thbs1)于1971年被发现，作为由活化血小板分泌的糖蛋白，该蛋白的主要功能与止血有关。然而，thbs1除了是tgf-β激活的主要调节因子，同时也具有多种与tgf-β无关的功能，如止血、细胞粘附、迁移、生长因子(egf、vegf、fgf)调节、抑制血管生成和一氧化氮信号传导等。thbs1
4、我们基于羊膜间充质干细胞条件培养基中外分泌蛋白的鉴定，进一步分析整合质谱数据。最终筛选并证实thbs-1可以促进人卵母细胞体外成熟。因此，羊膜干细胞外分泌蛋白thbs-1对于人卵母细胞体外成熟的促进作用，在临床上对于辅助生殖助孕的治疗及女性生育力保存具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1的筛选及其应用，以提高人卵母细胞体外成熟率，及胚胎体外培养结局。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1的筛选，包括
3、步骤一：采用健康剖腹产产妇的羊膜组织，用pbs反复冲洗去除粘液；
4、步骤二：用眼科手术剪将羊膜剪成约1mm×1mm小碎块，0.25％胰蛋白酶(trypsin-edta)，37℃消化30min后加入含血清的培养液，离心去上清，如此反复消化两次，再用pbs洗2-3次，去除上皮细胞；
5、步骤三：用细胞筛过滤后剩余的羊膜组织加入iv型胶原酶37℃消化60min，加入含血清的培养液终止消化，混匀后用200目细胞筛过滤，400g离心10min后重悬得到羊膜间充质干细胞(hamscs)，将细胞接种于dmem/f12培养基(添加10％胎牛血清和青链霉素)放置于5％co2的37℃培养箱中培养；
6、步骤四：选择培养至第三代的羊膜间充质干细胞，以2x106个细胞接种至75cm2培养瓶中；培养24小时后用pbs洗三遍，将培养基换成无血清培养基；继续培养24小时后收集无血清培养基，质谱分析羊膜间充质干细胞外分泌蛋白情况，从中筛选血小板反应蛋白1(thbs-1)。
7、本专利技术还提供另一种技术方案：一种如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1筛选后的应用，在人卵母细胞体外成熟(ivm)培养液中添加thbs-1，再加入75miu/ml fsh和75miu/ml lh；
8、对ivm培养后成熟的卵母细胞进行卵胞浆内单精子显微注射，之后用ivm卵裂培养液进行培养，培养液中添加thbs-1。
9、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
10、本专利技术鉴定了羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，筛选出人未成熟卵母细胞体外成熟过程中的促进因子thbs-1，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。
11、thbs-1作为人未成熟卵母细胞体外成熟过程中的促进因子，利用其作为培养液，能够有效提高成熟卵母细胞比例及可利用胚胎数。
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1.一种羊膜间充质干细胞外分泌蛋白THBS-1的筛选，其特征在于：包括
2.一种如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞外分泌蛋白THBS-1筛选后的应用，其特征在于：在人卵母细胞体外成熟(IVM)培养液中添加THBS-1，再加入75mIU/ml FSH和75mIU/ml LH；
3.根据权利要求2所述的羊膜间充质干细胞外分泌蛋白THBS-1筛选后的应用，其特征在于：将单精子显微注射后的卵母细胞在IVM卵裂培养液中培养至第三天，之后转移到囊胚培养液中继续培养到第六天。
4.根据权利要求3所述的羊膜间充质干细胞外分泌蛋白THBS-1筛选后的应用，其特征在于：添加在IVM培养液中的THBS-1浓度均为100ng/ml。
【技术特征摘要】
1.一种羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1的筛选，其特征在于：包括
2.一种如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞外分泌蛋白thbs-1筛选后的应用，其特征在于：在人卵母细胞体外成熟(ivm)培养液中添加thbs-1，再加入75miu/ml fsh和75miu/ml lh；
3.根据权利要求2所述的羊...
【专利技术属性】
技术研发人员：李彩虹，程东凯，庞希宁，
申请(专利权)人：沈阳菁华医院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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