一种犊牛体外胚胎培养液制造技术

本发明专利技术提供一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半胱胺。利用本发明专利技术提供的早期胚胎体外发育培养液对犊牛体外胚胎进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种培养液，具体地说，涉及一种犊牛体外胚胎培养液。
技术介绍
和多数哺乳动物一样，牛的卵泡发生于胎儿时期，在怀孕后期胎儿和出生后几天 的幼牛卵巢上都可以检测到有腔卵泡的存在，2月龄时数目达到50个左右，明显高于成年 母牛。因此，充分利用犊牛卵母细胞生产效率高于成年母牛数倍这一生理特点，发挥良种犊 牛最大遗传潜力成为奶牛繁殖新
中研究的热点之一。以犊牛为供体不仅可为胚胎体外生产提供大量的卵母细胞资源，满足卵母细胞冷 冻、胚胎分割、克隆和转基因等科研、生产的需求；而且还可以显著缩短世代间隔，加快育种 进程；充分发掘优良遗传性状母牛的繁殖潜能；加快优良牛群的扩群速度。若结合性控精 液进行研究，还可进一步加快育种进展，提高牛群的遗传改良速度与生产效率，为奶牛育种 提供丰富的遗传资源。目前，影响犊牛体外胚胎生产技术的因素主要包括激素超排处理方法、体外培养 体系、犊牛月龄、犊牛个体差异。其中体外培养体系是影响犊牛体外胚胎生产技术的重要因οRevel等对3月龄犊牛卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养进行了研究，结 果发现，受精率和卵裂率与成年牛差异不显著，但是，体外培养7d后囊胚率显著低于成年 牛，同样妊娠率也显著低于成年牛，这说明犊牛卵母细胞中控制囊胚形成的一些关键因子 可能尚未完全出现或表达。有学者指出，这可能是因为犊牛卵母细胞胞质存在缺陷造成的。谷胱甘肽(GSH)作为细胞内一种主要的自由硫醇基团，在细胞增殖、氨基酸运输、 蛋白质和DNA的合成、硫化物和其它化学物质分解以及保护细胞对抗氧化过程中具有重要 的生物学功能。谷胱甘肽在卵母细胞成熟的过程中大量合成积累，成熟后胚胎不再具有合 成谷胱甘肽的能力。成熟过程中卵母细胞内GSH水平的升高为下一步的受精以及胚胎分裂 提供更加适宜的细胞内环境，在体外成熟体系中添加半胱胺，β -巯基乙醇，半胱氨酸，胱氨 酸都能刺激牛卵母细胞合成GSH，但是只发现半胱胺能够增强胚胎的发育能力。半胱胺(Cysteamine，NH2CH2CH2SH,相对分子量为77. 15)，又称β —巯基乙胺(简 称CS)，相当于半胱氨酸的脱羧产物，是辅酶A分子的组成成分及动物体内的生物活性物 质，在体内具有重要的生理作用。在体外培养液中添加含有硫醇基团的半胱胺能够增强卵母细胞对半胱氨酸的吸 收，促进GSH的合成，增强卵母细胞对抗活性氧的能力，促进卵母细胞胞质的成熟。因此，在 体外成熟液中添加半胱胺能够提高卵裂率和囊胚率。但是半胱胺的添加要适量，否则会降 低囊胚发育率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种犊牛体外胚胎培养液。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半 胱胺。其中，半胱胺的含量为50 μ M-100 μ M，优选的半胱胺含量为ΙΟΟμΜ。前述的成熟培养液中还包括TCM199+10mMHEPES+5% FBS+0. 5 μ g/ml FSH+5 μ g/ ml LH+1 μ g/ml E2+27. 5 μ g/ml 丙酮酸钠 +100IU/ml 青链霉素。生产前述犊牛体外胚胎的方法包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体 外培养技术等。具体方法为1)犊牛激素超排选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植羊用CIDR，分别在第5d和第6d 注射FSH，第7d手术法采卵，利用9号针头采集卵巢上直径为3 6mm的卵泡液。2)犊牛卵母细胞体外成熟将步骤1)中得到的卵母细胞加入到成熟培养液中，在 38. 5°C,5% CO2，饱和湿度的条件下培养22-24h。3)将得到的犊牛成熟卵母细胞进行体外受精。4)受精卵在体外发育成胚胎。前述的方法，步骤1)中在第5d注射FSH，剂量为40mg-45mg，间隔12h注射 30mg-35mg，第 6d 注射 FSH，剂量为 30mg_35mg，间隔 12h 再注射 30mg_35mg。前述的方法，步骤2)中成熟培养液的成分TCM199+10mMHEPES+5% FBS+0. 5 μ g/ ml FSH+5 μ g/ml LH+1 μ g/ml E2+27. 5 μ g/ml 丙酮酸钠+100IU/ml 青链霉素+100 μ M 半胱胺。前述的方法，步骤3)中受精时间为8h。前述的方法，步骤4)包括在38. 55% C02，饱和湿度的条件下，将受精卵置于 前期发育培养液中培养2d，卵裂后移入后期发育培养液中继续培养，间隔2d半量换液一 次，胚胎发育第7d、8d统计囊胚数量；其中，所述CRI aa液114. 7mM NaCl+3. ImM KC1+26. 2mMNaHC03+10 μ g/ml 苯酚红 +ImM谷氨酸+0. 4mM 丙酮酸钠+5. 5mM半乳酸钙+2% EAA+1% NEAA+141mM MgCl26H20+100IU/ ml青链霉素，前期发育培养液为CR I aa液+6mg/ml BSA，后期发育培养液的成分为CR I aa 液+10% FBS。本专利技术采用含有半胱胺的体外成熟培养液对犊牛卵母细胞进行培养，可以获得较 高的囊胚发育率。本专利技术的优点在于(1)本专利技术建立了犊牛优质体外胚胎生产的技术规程，包括高效的卵母细胞体外 成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。犊牛卵母细胞的体外成熟率分别达到85%，体外受 精率达80 %，囊胚发育率达到35 %。(2)本专利技术采用含有半胱胺的体外成熟培养液对卵母细胞进行培养，可以获得较 高的囊胚发育率。附图说明图1为本专利技术较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外成熟后的成 熟卵母细胞。(显微镜下观察结果)图2为本专利技术较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发 育后获得的囊胚。(显微镜下观察结果)具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中胚胎体外生产的常规操作采用本领域技术人员熟知的方法和技术 进行。实施例中的犊牛来自于北京奶牛中心良种场的荷斯坦母犊牛。实施例1 犊牛激素超排及采卵犊牛超排处理当天用送栓器经阴道埋植羊用CIDR (羊用，产地新西兰)，分别在第 5d (40mg、30mg)、6d (30mg、30mg)间隔 12h 注射 FSH (FSH，商品名为 Fo 11 tronpin-V,购自加拿 大Bioniche AnimalHealth公司)，第7d采卵，同时撤栓。每次犊牛超排头均获得的可用卵母细胞数为48枚。实施例2 犊牛卵母细胞体外成熟体外成熟操作前2h在6孔圆锥型培养板的每孔中放入适量成熟培养液(平均每 枚卵母细胞10 μ 1成熟培养液)，上覆盖矿物油，放入38. 5°C的培养箱中预平衡。其中， 成熟培养液的成分为TCM199+10mMHEPES+5 % FBS+0. 5 μ g/ml FSH+5 μ g/ml LH+1 μ g/ml E2+27. 5 μ g/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100 μ M半胱胺。将经过鉴定可用的卵母细胞放到预热的成熟培养液中，轻轻洗涤4遍后，移入预 先在培养箱平衡2h的6孔圆锥型培养板的成熟液中，放入恒温培养箱中培养22h-24h。培 养条件为38. 5°C,5% CO2，饱和湿度。图1所示为本专利技术犊牛经激素超排后获得的卵母细 胞，经体外成熟后的成熟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种犊牛体外胚胎培养液，其特征在于，所述培养液中含有半胱胺。

【技术特征摘要】
一种犊牛体外胚胎培养液，其特征在于，所述培养液中含有半胱胺。2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液中半胱胺的含量为 50 μ M-100 μ Mo3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液中半胱胺的优选含量为 100 μ Mo4.根据权利要求1-3任一项所述的培养液，其特征在于，所述培...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玉林，吕小青，薛建华，宣柏华，李艳华，周高举，吴胜权，赵鹏，梁鸿斌，麻柱，
申请(专利权)人：北京奶牛中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]