【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，本专利技术提供了一种犬细小病毒亚单位疫苗的制备方法。
技术介绍
1、犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)主要是一种感染犬类动物的肠道病毒，尤其对幼犬的影响较为严重，感染会导致幼犬出现急性腹泻、发烧、白细胞减少以及心肌疾病等症状，而未接种疫苗的犬类动物死亡率非常高，因此在该领域中存在着提高犬类动物免于新型犬细小病毒感染的免疫力的疫苗的需求，特别是针对于现流行的cpv2c型特异性的疫苗需求明显。但是现有的犬细小病毒亚单位疫苗普遍存在的生产条件苛刻、工艺复杂、生产成本较高等问题。所以研制制备工艺简单、造价较低、安全性高的疫苗就显得十分重要。
2、现有研究显示，传统方法构建的用于犬细小病毒结构蛋白vp2表达的大肠杆菌表达系统存在表达效率低、表达蛋白免疫原性弱的缺陷，研究人员转而采用昆虫表达系统实现犬细小病毒结构蛋白vp2的高效表达，但是昆虫表达系统仍然具有生产流程复杂、生产条件要求严格、成本高等诸多缺陷，阻碍了该工艺的大规模应用。
3、大肠杆菌rosetta(de3)表达菌株，含有prare质粒，能够提供aua、agg、aga、cua、ccc和gga稀有密码子的trna，该质粒还具有氯霉素抗性，但是未被用于犬细小病毒的表达中。
4、本专利技术构建了犬细小病毒vp2结构蛋白的大肠杆菌rosetta(de3)表达系统，该系统的构建策略和表达过程具有发酵产量高、工艺简单，生产条件不高，生产成本低等优点，且制备出的犬细小病毒vp2结构蛋白的免疫原性高，为犬细小病毒亚单位
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用大肠杆菌rosetta(de3)制备犬细小亚单位疫苗的方法，为犬细小病毒亚单位疫苗的生产提供了一种替代选择。具体包括以下内容：
2、第一方面，本专利技术提供了一种犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
3、本专利技术提供了一种犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
4、s1设计编码犬细小病毒vp2结构蛋白的基因序列，所述编码vp2结构蛋白的核苷酸序列如seq id no：3所示；vp2结构蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；
5、s2合成编码his-sumo-vp2融合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如seqidno：4所示；his-sumo-vp2融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
6、s3将s2所述的his-sumo-vp2融合蛋白基因序列通过infusion重组技术克隆入原核表达载体pet28a，获得含编码his-sumo-vp2融合蛋白的核苷酸序列的重组表达载体；
7、s4将s3所述的重组表达载体转化至感受态大肠杆菌rosetta(de3)菌株中，获得用于生产犬细小病毒vp2结构蛋白的重组大肠杆菌rosetta(de3)菌株；
8、s5以s4所述的重组菌株为种子菌株在优化培养基条件下进行his-sumo-vp2融合蛋白的诱导表达，获得发酵液；
9、s6离心s5所述的发酵液，获得重组菌菌体，破碎菌体，取上清，备用；
10、s7取s6上清液进行亲和层析纯化，洗脱获得包含his-sumo-vp2蛋白的组分；
11、s8对包含his-sumo-vp2蛋白的组分进行sumo蛋白酶酶切处理，获得酶切处理液，酶切处理液包括vp2蛋白片段和his-sumo蛋白片段；
12、s9将步骤s8所述的酶切处理液进行孵育处理，使vp2蛋白自组装，形成自组装的vp2蛋白病毒样颗粒；
13、s10对步骤s9所述的孵育液进行分子筛纯化，最终获得犬细小病毒vp2蛋白病毒样颗粒。
14、优选的，所述s5中的优化培养基包括如下组分：胰蛋白胨25g/l、氯化钠0.5g/l、氯化铵0.5g/l、kh2po410g/l、mgso40.01 g/l和氯化钙0.005g/l。
15、优选的，s5中，所述重组菌株的发酵过程为：
16、(1)种子培养，将菌种划线接种在lb平板上，37℃培养12-15h，挑取单菌落接种于5ml lb培养基中，37℃，220rpm培养至od600至1.2，得活化种子液；
17、(2)将步骤(1)获得的活化种子液按照1％的接种量接入优化发酵培养基中，37℃220rpm培养至od600至1.0左右，得摇瓶种子液；
18、(3)分批补料发酵，初始发酵体积为发酵罐体积的50％，按照初始发酵体积的10％接种量接入摇瓶种子液，发酵温度为16℃，发酵初始阶段，进气设置为16l/min并逐渐增加至30l/min，搅拌速度为300rpm，初始溶氧设置为100％，通过控制转速维持后续溶氧为20-40％，当培养基中养料耗尽，溶氧上升后，通过补料维持溶氧仍为20-40％，待菌体生长进入对数生长期后期时，以流加的方式加入iptg至浓度为0.5mm，开始诱导，期间以时间梯度取样，整个发酵过程中，用氨水控制ph在7.0，诱导20h后，结束发酵。
19、本专利技术还提供了一种所述制备方法制备获得的犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒在制备犬细小病毒亚单位疫苗的应用。
20、优选地，所述制备方法制备获得的犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒在制备犬细小病毒亚单位疫苗的应用。
21、第二方面，本专利技术提供了一种犬细小病毒亚单位疫苗，所述犬细小病毒亚单位疫苗包括所述制备方法制备获得的犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒。
22、优选地，所述疫苗还包括佐剂。
23、优选地，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
24、本专利技术的有益效果：
25、①本专利技术提供了一种免疫效力高、安全性较好，能够预防犬细小病毒并提供有效保护的犬细小病毒亚单位疫苗；②本专利技术以rosetta(de3)菌株为出发点菌株构建了犬细小病毒结构蛋白vp2融合蛋白的重组表达菌株，相较于bl21(de3)重组菌株，具有更显著蛋白质折叠能力，产量显著增加。③本专利技术提供的纯化工艺简单，避免了成本较高的分子筛色谱层析纯化，不需要使用超速离心等复杂工艺，使得以工业化规模制备纯化犬细小病毒结构蛋白易于实现；④筛选组分适宜rosetta(de3)生长，发酵产量更高。
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1.一种犬细小病毒VP2结构蛋白的病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的犬细小病毒VP2结构蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述S5中的优化培养基包括如下组分：胰蛋白胨25g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵0.5g/L、KH2PO410g/L、MgSO40.01g/L和氯化钙0.005g/L。
3.如权利要求1所述的犬细小病毒VP2结构蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，S5中，所述重组菌株的发酵过程为：
4.如权利要求1-3任一所述制备方法制备获得的犬细小病毒VP2结构蛋白的病毒样颗粒在制备犬细小病毒亚单位疫苗的应用。
5.一种犬细小病毒亚单位疫苗，所述犬细小病毒亚单位疫苗包括如权利要求1-3任一所述制备方法制备获得的犬细小病毒VP2结构蛋白的病毒样颗粒。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂。
7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述s5中的优化培养基包括如下组分：胰蛋白胨25g/l、氯化钠0.5g/l、氯化铵0.5g/l、kh2po410g/l、mgso40.01g/l和氯化钙0.005g/l。
3.如权利要求1所述的犬细小病毒vp2结构蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，s5中，所述重组菌株的发酵过程为：
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