【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及到利用i类新型内含子自剪接活性在体外条件下环状rna的制备方法、以及获得的环状rna。
技术介绍
1、与传统技术相比，mrna疫苗具有更高的免疫原性、安全性及低成本规模级制备的显著优势，在基因编辑、细胞治疗与肿瘤新抗原疫苗等领域也具有广阔蓝海。然而，mrna本身的种种固有缺点也不容忽视。由于mrna易降解、难储藏的特性，moderna与biontech公司生产的mrna疫苗需要在-20℃或-70℃条件下进行储藏运输。除此以外，线性mrna会引发较强的免疫原性，往往需要对核酸进行修饰，例如使用假尿嘧啶取代尿嘧啶，才能够将其引发的免疫反应控制在合理范围内。这些严苛条件极大的限制了mrna技术的发展和应用。如何进行升级改造，实现mrna的常温储藏、免疫可控就成为了技术开发的当务之急。
2、circular rna(circrna)是一种首尾以共价键连接的闭合的环状rna，在真核细胞中广泛存在。因不具有线性mrna的poly a尾及5’末端和3’末端，circrna对rna酶消化和水解具有更强的抵抗力。在近年的研究中，越来越多的内源性circrna已经被发现具有翻译和蛋白表达的功能，为circrna的实际应用奠定了理论基础，chuyun chen等人更是证明在室温条件下储藏15天对circrna的翻译活性几乎没有影响，此外有研究者证明人工制备的circrna比线性mrna在真核细胞内具有更持久的蛋白表达及更低的非特异性免疫刺激。因此，circrna既继承了线性mrna的特点，同时拥有稳定、持久
3、当前的circrna体外制备方法主要包括酶连法以及利用具有自剪接功能的i型或ⅱ型内含子进行环化的pie技术(permuted intron-exon)。酶连法主要是指利用t4 dna或rna连接酶在atp的辅助下将线性mrna进行首尾连接，其主要优势在于较少的外源性碱基残留，然而这种方法对核酸链的长度有着严格要求，不适用于长链rna的环化，且无法保证rna的环化效率，不适用于circrna的规模级制备。pie技术最早可追溯到上世纪九十年代，由m.puttaraju和michael d.been共同提出，首次将剪切后的tetrahymena及anabaena的i型内含子连接在外显子两端，并在mg2+与gtp的催化下成功将线性mrna环化。由于当时年代技术的限制，这种环化效率并不理想且无法获得高纯度的circrna，难以实际应用于疫苗或药物开发等领域。直到2018年，r.alexander wesselhoeft等人对pie法进一步优化实现了以anabaena内含子为基础的高效率体外环化，然而这一方法会使circrna残留较多的外源性核酸序列，部分观点认为circrna的免疫原性与其残留的外源性核酸序列长度相关，可能会引起非特异性免疫。
4、除了利用i型内含子的pie系统外，ⅱ型内含子也可被改造用于circrna的制备，chuyun chen等人证明clostridium tetani的ⅱ型内含子的不同切割方式对circrna的环化效率有较大的影响，传统观点认为ⅱ型内含子的体内外剪接原理可能存在差异，其体外剪接机制仍需明确，对ⅱ型内含子的改造依然困难，是否具备普适性应用也仍不可知。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提供了基于pie系统的高效体外制备circrna的方法，将ivt(in vitro transcription，体外转录)制备的mrna高效环化成circrna，并具有较少的外源性碱基残留。
2、本专利技术通过部分i型内含子的改造，实现mrna的高效环化，提出了一种全新的pie制备circrna的方法。
3、本专利技术的第一方面，提供了用于体外制备环状rna的3’内含子和5’内含子的核酸分子，其序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
4、本专利技术的第二方面，提供了任一核酸分子seq id no.1-seq id no.2在体外制备环状rna中的应用。
5、本专利技术的第三方面，提供了用于体外制备环状rna的3’内含子和5’内含子，其截取于seq id no.1或seq id no.2的同一序列，且无重叠区域。
6、在其中的一些实施例中，所述3’内含子和5’内含子的组成构成seq id no.1或seqid no.2完整的序列。
7、在其中的一些实施例中，所述3’内含子与5’内含子来自于seq id no.1-seq idno.2中的任意片段，所述3’内含子大于5bp，或者是大于10bp，或是大于15bp，或是大于25bp，5’内含子大于5bp，或者是大于10bp，或是大于15bp，或是大于25bp来自与seq idno.1-seq id no.2中不重合的序列，且3’内含子与5’内含子组合成完整的seq id no.1-seq id no.2。
8、在其中的一些实施例中，其组成选自以下中的至少一组：
9、seq id no.3和seq id no.4；
10、seq id no.5和seq id no.6；
11、seq id no.7和seq id no.8；
12、seq id no.11和aaaca；
13、seq id no.13和seq id no.14；
14、seq id no.17和seq id no.18；
15、seq id no.19和seq id no.20；
16、seq id no.21和seq id no.22；
17、seq id no.23和seq id no.24；
18、seq id no.25和seq id no.26；
19、seq id no.29和seq id no.30；
20、seq id no.31和seq id no.32；
21、seq id no.47和seq id no.48。
22、在其中的一些优选实施例中，其组成选自以下中的至少一组：seq id no.3和seqid no.4；seq id no.11和aaaca；seq id no.13和seq id no.14；seq id no.17和seq idno.18；seq id no.21和seq id no.22；seq id no.23和seq id no.24。这些3’内含子和5’内含子体外制备环状rna时具有更高的环化效率，总体效果更好。
23、本专利技术的第四方面，提供了任一上述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状rna中的应用。
24、本专利技术的第五方面，提供了一种环状rna的体外制备方法。
25、一种环状rna的体外制备方法，包括下列步骤：
26、s1质粒构建：将t7启动子，5’同源臂，3’内含子，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.任一核酸分子SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2在体外制备环状RNA中的应用。
3.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列，且无重叠区域。
4.根据权利要求3所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其特征在于，所述3’内含子和5’内含子的组成构成SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2完整的序列。
5.根据权利要求3或4所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，所述3’内含子大于等于5碱基，5’内含子大于等于5碱基。
6.根据权利要求5所述的的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其组成选自以下中的至少一组：
7.根据权利要求6所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其组成选自以下中的至少一组：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.11和AAACA；S
8.权利要求3-7任一所述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状RNA中的应用。
9.一种环状RNA的体外制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述3’内含子和5’内含子如权利要求3-6任一项所述。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤s3包括以下：
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤s3包括以下：
13.根据权利要求9-12任一项所述制备方法得到的环状RNA。
14.根据权利要求13所述的环状RNA在制备mRNA疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于体外制备环状rna的3’内含子和5’内含子的核酸分子，其序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
2.任一核酸分子seq id no.1-seq id no.2在体外制备环状rna中的应用。
3.用于体外制备环状rna的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其截取于seq id no.1或seq id no.2的同一序列，且无重叠区域。
4.根据权利要求3所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其特征在于，所述3’内含子和5’内含子的组成构成seq id no.1或seq id no.2完整的序列。
5.根据权利要求3或4所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，所述3’内含子大于等于5碱基，5’内含子大于等于5碱基。
6.根据权利要求5所述的的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其组成选自以下中的至少一组：
7.根据权利要求6所述的3’内含子和5’内含子，其特征在于，其组成选自以下中的至少...
【专利技术属性】
技术研发人员：王弈，顾亦斐，何骏，王梨，万季，潘有东，赵钊，
申请(专利权)人：深圳新合睿恩生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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