【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物检测，尤其是涉及一种用于检测猪圆环病毒的引物组及其应用和检测方法。
技术介绍
1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14～17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，为共价闭合的单股环状负链dna，基因组大小约为1.76kb。pcv对外界理化因子的抵抗力相当强。即便在ph＝3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不能使其失活，无血凝活性。
2、2010年，有报道在轮状病毒疫苗rv1中检出pcv1，因此美国fda暂时禁止了rv1的使用，fda和疫苗厂家进行了更多研究发现rv5中含有pcv1和pcv2。猪圆环病毒的各种血清型(pcv1/pcv2/pcv3)存在共同感染现象，且pcv在细胞上不易产生细胞病变，难以观察。目前虽已有多种市售诊断试剂盒，但多针对于动物检疫，或多为普通pcr检测。并没有针对生物制品的检测产品。
3、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测猪圆环病毒的引物组、相应产品及检测方法，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
2、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
3、根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测猪圆环病毒的引物组，包括用于检测pcv1的引物、用于检测pcv2的引物和用于检测pcv3的引物；
4、所述用
5、所述用于检测pcv2的引物具有如seq id no.7所示的上游引物pcv2-f和如seq idno.8所示的下游引物pcv2-r；
6、所述用于检测pcv3的引物具有如seq id no.10所示的上游引物pcv3-f和如seqid no.11所示的下游引物pcv3-r。
7、本专利技术提供的引物组，其中pcv1分别选取rep和cap区的保守序列，pcv2、pcv3选取rep区的保守序列，并针对pcv1、pcv2设计特异性引物，能够使用四重pcr检测方法对pcv1/pcv2/pcv3病毒进行检测，具有快速、灵敏、高效等优点。
8、需要说明的是，本专利技术提供的引物组可用于不同类型的pcr反应。典型的当被用于常规pcr检测时，可根据扩增产物条带的有无及扩增产物的片段大小来判定待测样本中是否含有pcv1、pcv2或pcv3，或鉴别含有上述哪种病原体。典型的当被用于荧光定量pcr检测时，可以根据扩增产物中的荧光信号及扩增曲线，来判断待测样本中是否含有pcv1、pcv2或pcv3，或鉴别含有上述哪种病原体。当使用荧光定量pcr作为检测手段时，对其具体表征方法不做限定，例如可以为本领域常用的染料法或探针法。其中探针法的特异性要优于染料法，因此优选使用探针法进行表征。
9、基于此，在一些优选的实施方式中，本专利技术提供的引物组还包括用于检测pcv1的探针、用于检测pcv2的探针和用于检测pcv3的探针；
10、所述用于检测pcv1的探针具有如seq id no.3所示的pcv1-p1和如seq id no.6所示的pcv1-p2；
11、所述用于检测pcv2的探针具有如seq id no.9所示的pcv2-p；
12、所述用于检测pcv3的探针具有如seq id no.12所示的pcv3-p。
13、进一步的，所述pcv1-p1、pcv1-p2、pcv2-p和pcv3-p的两端均独立地分别含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团。本实施方式不限定具体的探针含有的荧光报告基团及荧光淬灭基团，能够与探针连接并起到相应表征作用的基团均可。
14、在一些优选的实施方式中，所述pcv1-p1含有fam，所述pcv1-p2含有hex，所述pcv2-p含有tamra，所述pcv3-p含有cy5；
15、优选地，所述pcv1-p1、pcv1-p2和pcv2-p含有bhq1，所述pcv3-p含有bhq2。
16、在一些优选的实施方式中，所述用于检测pcv1的引物、用于检测pcv2的引物和用于检测pcv3的引物的工作浓度分别独立的为8～12μm，例如可以为但不限于为8、9、10、11或12μm，或上述任意两点之间的范围值，优选为10μm；
17、可选地，所述用于检测pcv1的探针、用于检测pcv2的探针和用于检测pcv3的探针的工作浓度分别独立的为8～12μm，例如可以为但不限于为8、9、10、11或12μm，或上述任意两点之间的范围值，优选为10μm。
18、通过对引物和探针的工作浓度进行限定，避免工作浓度过低导致引物或探针降解，又避免浓度过高产生引物二聚体，同时，在优选工作浓度范围内也能够保证引物或探针的最大化利用，避免浪费。
19、基于与本专利技术提供的引物组相同的专利技术构思，本专利技术还提供了一种用于检测猪圆环病毒的产品，包括上述的引物组。
20、在一些具体的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
21、优选地，所述试剂盒还包括pcr反应液、阳性对照品或阴性对照品中的至少一种。
22、其中，pcr反应液包括进行pcr反应常用的试剂，具体的反应试剂的实例包括用于pcr反应的酶、盐、缓冲物质、缓冲液、dntp和稳定剂等，本专利技术对这些试剂不作限制。优选地，在pcr反应液中还包含本专利技术提供的引物组，含有本专利技术提供的引物组的pcr反应液已预先分装，使用时只需加入提取好的基因组核酸即可，操作简单方便。优选分装出的pcr反应液的体积为每个反应25μl。
23、通过设置阳性对照品和阴性对照品，能够有效避免检测出现的假阴性或假阳性结果，进一步保证了检测的准确性。
24、根据本专利技术的第二个方面，还提供了上述的引物组或产品在非诊断和治疗目的的检测猪圆环病毒中的应用。
25、根据本专利技术的第三个方面，本专利技术还提供了非诊断和治疗目的的检测猪圆环病毒的方法，包括以待测样本的基因组核酸为模板，使用上述的引物组或产品，进行荧光定量pcr反应；收集所述荧光定量pcr反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。
26、本专利技术提供的用于检测猪圆环病毒的方法，通过应用本专利技术提供的引物组或产品对待测样本进行pcr检测，根据不同检测结果，实现对pcv1、pcv2或pcv3的精确分子鉴别，具有操作简便，结果特异性好、灵敏度高等特点，在病原体检测和流行病学调查等领域具有重要的应用价值。
27、所述结果分析包括但不限于定性、半定量或定量分析。可选的实施方式，根据待测样本是否出现扩增曲线，定性的判断待测样本中是否存在猪圆环病毒；可选的实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测猪圆环病毒的引物组，其特征在于，包括用于检测PCV1的引物、用于检测PCV2的引物和用于检测PCV3的引物；
2.据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于检测PCV1的探针、用于检测PCV2的探针和用于检测PCV3的探针；
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述PCV1-P1、PCV1-P2、PCV2-P和PCV3-P的两端均独立地分别含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述PCV1-P1含有FAM，所述PCV1-P2含有HEX，所述PCV2-P含有TAMRA，所述PCV3-P含有CY5；
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物组，其特征在于，所述用于检测PCV1的引物、用于检测PCV2的引物和用于检测PCV3的引物的工作浓度分别独立的为8～12μM，优选为10μM；
6.一种用于检测猪圆环病毒的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-5任一项所述的引物组；
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还
8.权利要求1-5任一项所述的引物组、或权利要求6或7所述的产品在非诊断和治疗目的的检测猪圆环病毒中的应用。
9.非诊断和治疗目的的检测猪圆环病毒的方法，其特征在于，包括以待测样本的基因组核酸为模板，使用权利要求1-5任一项所述的引物组、或权利要求6或7所述的产品，进行荧光定量PCR反应；收集所述荧光定量PCR反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当所述待测样本的Ct≤39.99且有明显的扩增曲线，且空白对照的Ct＞39.99或无明显的扩增曲线时，所述荧光信号用于结果分析。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒的引物组，其特征在于，包括用于检测pcv1的引物、用于检测pcv2的引物和用于检测pcv3的引物；
2.据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于检测pcv1的探针、用于检测pcv2的探针和用于检测pcv3的探针；
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述pcv1-p1、pcv1-p2、pcv2-p和pcv3-p的两端均独立地分别含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述pcv1-p1含有fam，所述pcv1-p2含有hex，所述pcv2-p含有tamra，所述pcv3-p含有cy5；
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物组，其特征在于，所述用于检测pcv1的引物、用于检测pcv2的引物和用于检测pcv3的引物的工作浓度分别独立的为8～12μm，优选...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨英，王瑶，饶春明，李瑶玲，袁子维，魏夏杰，房吉庆，孙云霞，李开通，汪宁，周金，
申请(专利权)人：北京昭衍药物检定研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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