【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物防治，尤其涉及一株铜绿假单胞菌及在番茄灰霉病防治中的应用。
技术介绍
1、番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，对保护地番茄生产构成极大威胁。幼苗期和成株期均可发病，花果叶茎均可受害，尤以青果受害最重，一般导致番茄减产30％以上，对番茄的产量和品质影响很大。目前国内各地均有发生，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍。目前，由于尚未发现灰霉病的抗源，抗病育种难以进行，番茄灰霉病的防治仍依靠化学药剂进行防治。
2、然而，长期、连续用药使病原菌逐渐产生了抗药性影响了防治效果，同时造成环境污染，也造成了果实的农药污染。因而寻找和筛选对番茄灰霉病菌有强烈抑制作用的微生物菌株，是番茄灰霉病防治的主要方向。利用生物农药替代化学农药防治植物病害虽可避免抗药性病原菌株的产生，但具有防治机理不清楚、防效较慢，效果不稳定等缺点。
3、生物农药主要是生防菌剂，其作为一种新兴的防治措施，与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防菌剂防治方法是采用微生物对灰霉进行杀灭，目前已经开始在农业上推广使用。
4、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)又是假单胞菌的一种，可产生吩嗪-1-羧酸、藤黄绿脓菌素、2，4-二乙酰藤黄酚等多种活性物质，对水稻纹枯病、稻瘟病、烟草黑胫病、油菜菌核病、杂交竹梢枯病等多种植物病原菌具有抑制作用。
5、但是现有技术中还未有将铜绿假单胞菌在番茄灰霉病防治中进行应用的报道。
技术实现思
1、1.要解决的技术问题
2、本专利技术的目的是为了解决现有技术中还未有将铜绿假单胞菌在番茄灰霉病防治中进行应用的问题，而提出的一株铜绿假单胞菌及在番茄灰霉病防治中的应用。
3、2.技术方案
4、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
5、一株铜绿假单胞菌，所述菌株为铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa 2135，已于2023年12月04日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，其保藏编号为cctcc no：m20232449。
6、本专利技术中还提出了一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，包括以下步骤：
7、步骤1：生防菌株的分离，采用平板稀释法分离土壤及植株根茎中的生防菌；
8、步骤2：生防菌株的筛选，采用平板对峙培养法测定已分离出的细菌对番茄灰霉病菌的抑制作用；
9、步骤3：生防菌株的鉴定，具体包括以下步骤：
10、s3.1：培养特征观察，将活化后的菌株划线培养于lb固体培养基上，30℃培养48h，观察菌落颜色和形态，同时进行革兰氏染色；
11、s3.2：分子生物学鉴定，菌株采用16s rdna基因序列分析并对生防菌进行序列鉴定。
12、优选地，所述步骤1中平板稀释法具体步骤为：将土样用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1ml，涂布于固体lb培养基上；将植株根茎清洗干净，用灭菌刀片剖开根茎，切取根和茎里面的组织，用磷酸缓冲液研磨，用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1m l，涂布于固体lb培养基上，将平板置于37℃培养箱中培养24h，选取菌落形态不同的单个菌落，进一步划线培养观察菌落性状和保存，每个试验重复3次。
13、优选地，所述步骤2中平板对峙培养法的具体步骤为：将在pda培养基上培养7d的灰霉病菌，用直径6mm打孔器打出菌饼，用接种针将菌饼放置于pda平板中央，然后在距离菌饼2cm处用灭菌牙签点接拮抗菌株，设不点接拮抗菌株的平板为对照，25℃培养，当对照长满整个培养皿时测量菌落半径，挑出能形成明显抑菌圈的细菌，记录并保存，每个试验重复3次；抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100。
14、优选地，所述s3.2中使用tsingke植物dna提取试剂盒提取菌株dna，采用通用引物27f(5’-agtttgatcmtggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩；送至擎科生物有限公司完成测序工作，测序结果于ncbi数据库blast比对分析并用mega 7.0软件比对后采用neighbor-joining模型构建系统发育树。
15、本专利技术中还提出了一株铜绿假单胞菌应用于番茄灰霉病的生防。
16、3.有益效果
17、相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
18、本专利技术中，菌株是从番茄根部周围土壤中筛选到的1株细菌，经初步试验发现该菌对番茄灰霉病菌botrytis cinerea具有较强拮抗活性，本专利技术对该菌株进行了形态观察、生理生化反应和16s r dna序列分析等分类鉴定，并对其发酵培养基成分和发酵条件进行了优化，为深入研究该菌的防病机制和开发利用提供基础资料。
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1.一株铜绿假单胞菌，其特征在于，所述菌株为铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa 2135，已于2023年12月04日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，其保藏编号为CCTCC NO：M 20232449。
2.根据权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤1中平板稀释法具体步骤为：将土样用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1mL，涂布于固体LB培养基上；将植株根茎清洗干净，用灭菌刀片剖开根茎，切取根和茎里面的组织，用磷酸缓冲液研磨，用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1m L，涂布于固体LB培养基上，将平板置于37℃培养箱中培养24h，选取菌落形态不同的单个菌落，进一步划线培养观察菌落性状和保存，每个试验重复3次。
4.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤2中平板对峙培养法的具体步骤为：将在PDA培养
5.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述S3.2中使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒提取菌株DNA，采用通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩；送至擎科生物有限公司完成测序工作，测序结果于NCBI数据库Blast比对分析并用MEGA 7.0软件比对后采用Neighbor-Joining模型构建系统发育树。
6.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的应用，其特征在于，应用于番茄灰霉病的生防。
...【技术特征摘要】
1.一株铜绿假单胞菌，其特征在于，所述菌株为铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa 2135，已于2023年12月04日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，其保藏编号为cctcc no：m 20232449。
2.根据权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤1中平板稀释法具体步骤为：将土样用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1ml，涂布于固体lb培养基上；将植株根茎清洗干净，用灭菌刀片剖开根茎，切取根和茎里面的组织，用磷酸缓冲液研磨，用无菌水稀释成10-1-10-5浓度的悬液，吸取10-5浓度的悬液上清液0.1m l，涂布于固体lb培养基上，将平板置于37℃培养箱中培养24h，选取菌落形态不同的单个菌落，进一步划线培养观察菌落性状和保存，每个试验重复3次。
4.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述步骤2...
【专利技术属性】
技术研发人员：周艳芳，王秀芝，张晓梅，董喆，曲宝茹，唐雨，孟令强，崔聪聪，李杰，孙军玲，姚宇涵，
申请(专利权)人：赤峰市农牧科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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