【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物产酶技术、石油开采领域应用，特别涉及一种利用枯草芽孢杆菌制备β-甘露聚糖酶及在破胶应用。
技术介绍
1、甘露聚糖的来源丰富，在魔芋粉、瓜胶、刺槐豆胶等中都有不同种类的甘露聚糖存在。对甘露聚糖降解的生物酶有β-甘露聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶。其中，最主要的就是β-甘露聚糖酶。β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶，能够水解含有β-1,4-d-甘露糖苷键的甘露多糖及寡糖，广泛存在于动植物和微生物中。其中，微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源，具有活性高、来源稳定的优点。
2、目前对于β-甘露聚糖酶的基本性能研究已经取得成效，对其在各个领域的开发利用也已经步入正轨，β-甘露聚糖酶在造纸、食品、保健品、医药等领域取得了广泛应用。而在石油开采行业上的研究，虽然也取得了较大进步，但是在此领域的应用还没有全面覆盖。在石油开采领域中，水力压裂是以植物胶为稠化剂的水基压裂体系，具廉价、安全、应用范围广的特点。但是，压裂后的残渣、未破胶的浓缩胶和滤饼造成的导流能力损害主要靠加入破胶剂来解决。常规的氧化破胶剂有很多缺陷，比如高温下与压裂液反应迅速，使压裂液提前降解而失去输送支撑剂能力；会与其他遇到的地层基质和烃类反应，造成地层污染；还有可能达不到破胶效果。
技术实现思路
1、本专利技术旨在于克服现有技术不足，提供了一种利用枯草芽孢杆菌制备β-甘露聚糖酶及在破胶应用；目的其一提供一种能够产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，并得到一种种子配方及发酵配方；其二利用枯草芽孢杆菌产生的菌
2、本专利技术的的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年8月23日，保藏编号为cgmccno.28224。
3、作为本专利技术的进一步改进，所述的枯草芽孢杆菌的基因序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)在制备β-甘露聚糖酶中的应用。
5、本专利技术的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：
6、(1)采用含有刺槐豆胶和氮源的培养基培养枯草芽孢杆菌，培养温度30～37℃、ph6～8；
7、(2)将步骤(1)得到的菌液离心去除菌体后得到β-甘露聚糖酶粗酶液；
8、所述培养基中刺槐豆胶浓度为5g/l～20g/l，所述氮源浓度为1.0g/l～2.0g/l。
9、作为本专利技术的进一步改进，所述培养基中含有fe2+。
10、作为本专利技术的进一步改进，所述培养基中fe2+浓度为0.005g/l～0.015g/l。
11、作为本专利技术的进一步改进，所述培养基中含磷酸氢二钾0.4～0.6g/l，硫酸镁0.4～0.6g/l。
12、作为本专利技术的进一步改进，所述的氮源为酵母浸粉4～6g/l或氯化铵1～3g/l。
13、利用一种枯草芽孢杆菌制备的β-甘露聚糖酶在破胶中的应用，包括下列步骤：
14、(1)、将β-甘露聚糖酶粗酶液与脂肽类表面活性剂10：1～2复配制成破胶剂；
15、(2)、破胶剂的用量为压裂液的浓度0.03％～0.5％；
16、(2)、压裂温度30℃～60℃。
17、本专利技术的一种利用枯草芽孢杆菌制备β-甘露聚糖酶，酶活性高，在破胶时具有专一性，不与其他物质反应，降解高效性，使残渣量大大降低，不会对地层造成污染。而且生物酶破胶剂还具有成本低、效率高、适用地层范围广、工艺简单等特点。
18、实施方式
19、下面对本专利技术实施例中的技术方案进行描述，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
20、1、菌株的分离与鉴定
21、(1)样品采集：样品来自大庆市让胡路区宏伟村大豆种植地豆科植物根部土壤；
22、(2)样品前处理，取1g土壤样品于灭菌后的去离子水中，在80℃下加热处理10min，保留芽孢类菌种，去除其他菌种；
23、(3)菌种筛选：将上述处理过的悬浊液取进行逐级稀释，三10-7、10-8、10-9个梯度在固体培养基平板划线，37℃培养24h，将培养后挑出的单菌落在lb平板中涂布37℃培养24h，同步进行多块平板的培养，然后用k-ki溶液滴入培养好的平板中，观察水解圈情况，将水解圈较大的菌挑出于种子培养基富集培养，培养条件37℃，得种子液。
24、2、酶活定义和测定方法如下：
25、酶活：在实验条件下，以0.5％刺槐豆胶为底物，在60℃水浴中反应10min，每分钟产生相当于1μmold-甘露糖的还原糖所需要的酶的量为1酶活力单位(u)。
26、酶活测定方法：在0.9ml质量浓度5g/l的刺槐豆胶底物(ph6.5,0.05mol/l磷酸缓冲液配置)中加入适当稀释的酶液0.1ml，置于60℃水浴中反应10min，加入dns试剂1ml，置于沸水浴中煮沸5min，显色，冷却，蒸馏水定容至10ml，空白液调零，在540nm处测定吸光度。
27、酶活力计算公式：
28、
29、式中：10—定容体积(ml)，
30、f—由标准曲线检测得到的葡萄糖浓度(μg/ml)，
31、n—稀释倍数，
32、v—加入酶液体积(ml)，
33、t—反应时间(min)，
34、180—葡萄糖摩尔质量(g/mol)。
35、实施例1
36、本专利技术的β-甘露聚糖酶粗酶液的制备：
37、用刺槐豆胶20g/l、氯化铵1g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸亚铁0.01g/l、余量为水制成的培养基，调节ph为7.4-～7.6，在培养基上接种枯草芽孢杆菌，在温度为37℃、180rpm下摇瓶培养时间为24h后。离心去除细胞后获得粗酶液，粗酶液在60℃下，反应10min测定最大酶活为103.82u。
38、实施例2
39、本专利技术的β-甘露聚糖酶粗酶液的制备：
40、培养基为刺槐豆胶5～15g/l、氯化铵0.5～1.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸亚铁0.01g/l、其余为水，ph为6～8，接种枯草芽孢杆菌，在温度30～37℃、180rpm下摇瓶培养时间为24h。离心去除细胞后获得粗酶液，粗酶液在60℃下，反应10min测定最大酶活为186.4u，见下表。
41、
42、可见，上述制得的β-甘露聚糖酶粗酶液，其酶活性均大于100u，活性较高，其配方发酵得到的酶液可以应用于后续破胶实验。
43、实施例3
44、本专利技术β-甘本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)，其特征在于：该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年8月23日，保藏编号为CGMCC No.28224。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在制备β-甘露聚糖酶中的应用。
4.利用如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于：所述培养基中含有Fe2+。
6.如权利要求5所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于：所述培养基中Fe2+浓度为0.005g/L～0
7.如权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于：所述培养基中含磷酸氢二钾0.4～0.6g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L。
8.如权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于：所述的氮源为酵母浸粉4～6g/L或氯化铵1～3g/L。
9.利用权利要求4制备的β-甘露聚糖酶在破胶中的应用，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其特征在于：该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年8月23日，保藏编号为cgmcc no.28224。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的基因序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)在制备β-甘露聚糖酶中的应用。
4.利用如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌(bacillus ...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛亚庆，戚桂娜，李国军，
申请(专利权)人：大庆华理生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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