【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种负荷可调的心肌微生理模型及其应用，属于体外疾病模型。
技术介绍
1、心肌病是导致心力衰竭的重要病因，在全球每年导致数百万人死亡。心肌病分为缺血性心肌病、扩张性心肌病、肥厚型心肌病等，具有极其复杂的环境及遗传学病因。目前对心肌病的机制研究主要是通过二维细胞培养和动物疾病模型来进行的。在二维培养条件下，心肌细胞的生理状态与体内细胞差异巨大，不能准确反映心肌病的病理生理；而动物疾病模型实验周期长、成本高，同时难以模拟庞大的人类心肌病基因突变类型。
2、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy，dcm)是一种以心脏明显扩大伴心室收缩功能障碍为特征的非缺血性心肌病，发病多为中青年，其病因复杂，其中涉及包括ttn、bag3、flnc、lmna等数十种功能各异基因的突变。最新的国外研究显示，10-35％的dcm患者在进行心脏减负荷治疗(心室辅助装置)达到数个月后，其原本衰弱的心脏功能可得到明显恢复从而免于心脏移植，该种dcm的临床表型被称为压力反应型dcm。然而，目前尚无研究阐明何种基因突变导致的dcm患者能够从心脏减负荷治疗中获益。因为dcm所涉及基因过于广泛，且缺乏能够长期植入小鼠的心室辅助装置，相关研究受到了很大的限制。
3、微生理模型是一种新型的基于微制造技术构建的体外疾病模型，能够在极小的体外环境(微米-毫米级)中模拟体内细胞所处的生物及力学微环境。最新文献提示，心肌微生理模型能够模拟正常心脏组织的生理病理特征，可作为药物筛选平台为临床试验提供证据(european hea
技术实现思路
1、本专利技术的目的是：为了解决目前用于研究心肌病机制的疾病模型存在与体内细胞差异巨大，不能准确反映心肌病的病理生理或模型实验周期长、成本高，同时难以模拟庞大的人类心肌病基因突变类型等技术问题，本专利技术旨在构建一种负荷可调的心肌微生理模型，用于心肌病机制研究及个体化治疗。
2、为了达到解决上述技术问题的目的，本专利技术提供一种负荷可调的心肌微生理模型的构建方法，包括以下步骤：
3、步骤1：分别制作成熟部pdms和减压部pdms，其中，所述成熟部pdms的基础结构为圆柱体(该圆柱体的尺寸大小对应于用于培养的多孔板的单孔大小，多孔板可以选择6孔板、12孔或者24孔板)，其上表面设有至少一组用于凝胶环成熟化的初始微柱对，每组初始微柱对包括两个初始微柱及对应的圆柱体支撑部(该支撑部用于支撑微柱，防止微柱垂下或断裂)；所述减压部pdms的基础结构为圆柱体，其上表面设有至少一组用于减压测试的微柱对，每组微柱对包括三联排圆柱体支撑部及对应的三个相互独立的微柱、单个圆柱体支撑部及对应的微柱；所述成熟部pdms和减压部pdms的各部分制作材料均为pdms；(由于环形凹槽是用于凝胶的固化，形成的凝胶环需要套在微柱对之间，因此，环形凹槽的尺寸设计应和成熟部、减压部微柱对之间的间距相匹配)。
4、步骤2：制备细胞-凝胶混合物；
5、步骤3：心肌凝胶环的成熟与减压，分别将步骤1制作的成熟部pdms、减压部pdms与铂电极安装于多孔细胞培养板中，成熟部的环形凹槽供细胞-凝胶混合物凝固，待凝固后取出凝胶环套入成熟部的初始微柱间，施加周期性电信号促成熟后取出，套入减压部三联排和单个圆柱体支撑部上的微柱间，施加周期性电信号后进行不同程度减压和正常压力的测试。
6、优选地，所述成熟部pdms的圆柱体上表面从外到内设有呈对称阵列分布的a)4个用以凝胶固化的环形凹槽和b)4对圆柱体支撑部，所述圆柱体支撑部上对应设有d)4对初始微柱；每一对所述的圆柱体支撑部之间设有c)长方体支撑部(该长方体支撑部用于水凝胶成熟过程中起到支撑作用，防止胶从两个微柱间垂下或者断裂)；所述减压部pdms的基础结构为圆柱体，其上表面设有呈对称阵列分布的三联排圆柱体支撑部和单个圆柱体支撑部，包括4对呈两列分布的三联排圆柱体支撑部和4对呈两列分布单个圆柱体支撑部，所述的两列三联排圆柱体支撑部之间不相邻，每一个所述的三联排圆柱体支撑部上分别设有相互独立的三个微柱，每一个所述的单个圆柱体支撑部上分别设有对应的微柱；(该优选方式中，微柱对的数量是根据六孔板的大小尺寸设计的，微柱的数量和组合也可根据培养孔更改，比如使用更小的12孔或者24孔板，相应的微柱的数量和组合会变化)。
7、优选地，所述步骤2中凝胶基质的制备具体包括以下步骤：
8、步骤2.1：取纤维蛋白原粉末和凝血酶粉末，分别完全溶解于pbs缓冲液，制备纤维蛋白原工作液和凝血酶工作液；
9、步骤2.2：取纤维蛋白原工作液置于冰上；
10、步骤2.3：消化ipsc来源心脏细胞，离心弃上清，收集细胞沉淀；
11、步骤2.3：细胞沉淀加dmem培养基以及凝血酶工作液，充分混匀后加入纤维蛋白原工作液中，充分混匀，即为细胞-凝胶混合物。
12、优选地，所述步骤2.3中的ipsc来源心脏细胞为利用心肌病人外周血或尿路上皮细胞进行诱导ipsc及后续重分化得到的ipsc重分化心肌细胞和成纤维细胞。
13、优选地，所述步骤2.3中的ipsc来源心脏细胞为乳鼠原代心脏细胞或转基因小鼠心脏细胞ipsc重分化的心脏细胞。
14、本专利技术还提供了上述构建方法构建的心肌微生理模型。
15、本专利技术还提供了上述构建方法构建的心肌微生理模型在在体外模拟心脏负荷变化，心肌病个体化减压治疗测试和减压治疗的影响机制研究中的应用。
16、本专利技术还提供了上述构建方法构建的心肌微生理模型在研究特定基因突变对心肌接受减压/增压处理后的影响中的应用。
17、本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：
18、本专利技术设计的微生理模型除小型、稳定、无需实验动物、易于后期数据分析等优点外，其最大的特点在于专利技术了一种实现装置内心脏细胞压力调节的方法，该种方法从空间上将细胞凝胶环的成熟过程与减压处理过程进行分隔，明显降低了1)长时间固定位置三维培养带来的污染风险；2)从凝胶中移位至培养孔底部细胞的干扰；以及3)设计、制备、装配及维护的困难程度；该方法在既往文献中无类似报道；结合干细胞技术使得装置能够对临床病人进行个体化测试；通过分析不同基因背景病人来源的细胞对减压处理的功能恢复情况，可筛选出恢复程度较高的患者，指导临床治疗方法的选择。
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1.一种负荷可调的心肌微生理模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述成熟部PDMS的圆柱体上表面从外到内设有呈对称阵列分布的a)4个用以凝胶固化的环形凹槽和b)4对圆柱体支撑部，所述圆柱体支撑部上对应设有d)4对初始微柱；每一对所述的圆柱体支撑部之间设有c)长方体支撑部；所述减压部PDMS的基础结构为圆柱体，其上表面设有呈对称阵列分布的三联排圆柱体支撑部和单个圆柱体支撑部，包括4对呈两列分布的三联排圆柱体支撑部和4对呈两列分布单个圆柱体支撑部，所述的两列三联排圆柱体支撑部之间不相邻，每一个所述的三联排圆柱体支撑部上分别设有相互独立的三个微柱，每一个所述的单个圆柱体支撑部上分别设有对应的微柱。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2中凝胶基质的制备具体包括以下步骤：
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2.3中的iPSC来源心脏细胞为利用心肌病人外周血或尿路上皮细胞进行诱导iPSC及后续重分化得到的iPSC重分化心肌细胞和成纤维细胞。
5.如权利要求2
6.权利要求1～5中任意一项所述的构建方法构建的心肌微生理模型。
7.权利要求1～5中任意一项所述的构建方法构建的心肌微生理模型在体外模拟心脏负荷变化，心肌病个体化减压治疗测试和减压治疗的影响机制研究中的应用。
8.权利要求1～5中任意一项所述的构建方法构建的心肌微生理模型在研究特定基因突变对心肌接受减压/增压处理后的影响中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种负荷可调的心肌微生理模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述成熟部pdms的圆柱体上表面从外到内设有呈对称阵列分布的a)4个用以凝胶固化的环形凹槽和b)4对圆柱体支撑部，所述圆柱体支撑部上对应设有d)4对初始微柱；每一对所述的圆柱体支撑部之间设有c)长方体支撑部；所述减压部pdms的基础结构为圆柱体，其上表面设有呈对称阵列分布的三联排圆柱体支撑部和单个圆柱体支撑部，包括4对呈两列分布的三联排圆柱体支撑部和4对呈两列分布单个圆柱体支撑部，所述的两列三联排圆柱体支撑部之间不相邻，每一个所述的三联排圆柱体支撑部上分别设有相互独立的三个微柱，每一个所述的单个圆柱体支撑部上分别设有对应的微柱。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2中凝胶基质的制备具...
【专利技术属性】
技术研发人员：马文锐，袁莉，刘峻江，张炜佳，王春生，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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