【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于功能化高分子材料领域，具体涉及一种n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂及其制备方法与应用。
技术介绍
1、生物分子广泛存在着n-磷酸化修饰，例如，n-磷酸化生物小分子、n-磷酸化蛋白、n-磷酸化肽段等等，它们在细胞信号传导、代谢调节、免疫功能调控等重要的生命过程中扮演着作用，许多含有n-磷酸化修饰的生物分子是疾病甚至癌症的发生、发展的生物标记物或药物治疗靶点。因而，发展可对含有n-磷酸化修饰的生物分子进行直接检测的检测试剂或方法对于癌症的早期预警、靶向治疗等具有重要意义。
2、n-磷酸化修饰的生物分子的检测难点在于常规的生物分子磷酸化修饰检测试剂需在强酸性条件下方可实现生物分子磷酸化修饰的有效识别，而n-磷酸化修饰的生物分子的磷酸化修饰在强酸条件下不稳定，易发生去磷酸化。因此，如何在弱酸或近中性条件下实现n-磷酸化修饰的生物分子的特异性检测一直是技术难点。
3、目前，针对n-磷酸化修饰的特异性检测手段极少，其中主要包括免疫检测法、质谱法和同位素法。其中，免疫检测法需制备高特异性、高亲和力的抗体，而n-磷酸化蛋白、n-磷酸化氨基酸作为抗原免疫实验动物时极易发生去磷酸化，难以产生有效抗体。即使目前已有研究者开发了多种n-磷酸化氨基酸类似物作为抗原制备抗体，但制备出的n-磷酸化抗体大多仅能识别单一位点，对于不同位点的n-磷酸化检测需发展不同的抗体，因此迫切需要一种普适性的n-磷酸化修饰检测新方法。
4、近年来，采用亲和材料对n-磷酸化蛋白进行富集的方法逐渐发展起来。如中国专利cn11120
5、但该双二甲基吡啶胺双锌功能化介孔核壳硅球上并没有键合可检测的官能团或抗体基团，或含有可与被检测官能团相结合的官能团或抗体基团，而且介孔核壳硅球为固相材料，不能溶于水，其在n-磷酸化修饰的生物分子检测中难以作为检测试剂直接应用于生物样品检测中应用最广泛的western blot、sds-page、elisa等检测技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂及其制备方法与应用，本专利技术提供的n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂在酸性、中性和碱性条件下均可以直接用于含有n-磷酸化修饰的生物分子的检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂，包括pincer类型双金属官能化树枝状聚合物；所述官能化树枝状聚合物由包括a组分和b组分的原料制备得到；
4、所述a组分为树枝状聚合物；
5、所述b组分为pincer类型配体-双金属配位化合物；所述pincer类型配体-双金属配位化合物为pincer类型配位-双锌配位化合物或pincer类型配位-双铜配位化合物。
6、优选的，所述官能化树枝状聚合物还键合有c组分，所述c组分为可实现直接检测的官能团或可实现直接检测的抗体基团。
7、优选的，所述官能化树枝状聚合物还键合有d组分，所述d组分为可与c组分相结合的官能团或可与c组分相结合的抗体基团。
8、优选的，所述树枝状聚合物为聚酰胺-胺型树枝状聚合物或聚酰胺-胺型树枝状聚合物的共嵌树枝状聚合物。
9、优选的，所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物为第二代到第十代中的一种或几种。
10、优选的，所述b组分为含有杂原子配位的pincer类型配位-双金属配位化合物，由含有杂原子配位的pincer类型配体和金属离子得到；
11、所述杂原子包括氧、氮和硫中的一种或几种；
12、所述含有杂原子配位的pincer类型配体包括2,2’-二甲基吡啶胺、2,2’-二甲基吡唑胺、2,2’-二甲基嘧啶胺、2,2’-二甲基喹啉胺、2,2’-二甲基噻唑胺、2,2’-二甲基呋喃胺和2,2’-二甲基异喹啉胺中的一种或几种。
13、优选的，所述c组分中可实现直接检测的官能团包括荧光基团或发光基团；
14、所述d组分中可与c组分相结合的官能团包括生物素、半抗原或交联基团。
15、本专利技术还提供了上述方案所述检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
16、(1)将树枝状聚合物溶液与pincer类型配体溶液和金属离子溶液混合进行偶联反应，得到含有pincer类型双金属官能化树枝状聚合物的溶液；所述金属离子溶液为锌离子溶液或铜离子溶液；
17、(2)将所述含有pincer类型双金属官能团化树枝状聚合物的溶液纯化，得到n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂。
18、优选的，所述pincer类型配体溶液的制备方法为：将胺类化合物、多聚甲醛和第一溶剂混合进行曼尼希反应；将所得反应产物和n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸进行第一酰胺化反应；将所得产物纯化后与二氯甲烷和三氟乙酸混合进行脱除保护基反应；将所得反应产物和含酸酐二氯甲烷溶液进行第二酰胺化反应，得到羧基封端的四臂胺化合物；将所述羧基封端的四臂胺化合物、二甲基亚砜、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行第三酰胺化反应，得到pincer类型配体溶液。
19、本专利技术还提供了上述方案所述检测试剂或上述方案所述制备方法得到的检测试剂在制备检测含有n-磷酸化修饰的生物分子的试剂盒中的应用。
20、本专利技术提供了一种n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂。本专利技术使用树枝状聚合物为基质，以固载含有pincer类型配体-双金属配位化合物的官能团。树枝状聚合物一方面具有优异的水溶性，本专利技术以其为基质的n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂，可在水相中实现n-磷酸化修饰生物分子的特异性检测，有利于其直接应用于生物样品检测中应用最广泛的western blot、sds-page、elisa等检测技术。另一方面，树枝状聚合物具有独特的超支化结构和纳米尺度，其表面含有密集的表面活性官能团，可实现多个pincer类型配体-双金属配位化合物官能团的同时固载，有利于提高所述n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂对n-磷酸化修饰生物分子的亲和力，进而提高对n-磷酸化修饰生物分子的检测特异性。此外，本专利技术中所述的含有pincer类型配体-双金属配位化合物的官能团可在弱酸或近中性条件下实现对n-磷酸化修饰生物分子的特异性识别，该条件下n-磷酸化修饰生物分子的稳定性高，可有效避免其去磷酸化，进而有效提高了对n-磷酸化修饰生物分子的检测灵敏度。
21、本专利技术利用该检测试剂，可以直接用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种N-磷酸化修饰生物分子的检测试剂，其特征在于，包括Pincer类型双金属官能化树枝状聚合物；所述官能化树枝状聚合物由包括A组分和B组分的原料制备得到；
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述官能化树枝状聚合物还键合有C组分，所述C组分为可实现直接检测的官能团或可实现直接检测的抗体基团。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述官能化树枝状聚合物还键合有D组分，所述D组分为可与C组分相结合的官能团或可与C组分相结合的抗体基团。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述树枝状聚合物为聚酰胺-胺型树枝状聚合物或聚酰胺-胺型树枝状聚合物的共嵌树枝状聚合物。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物为第二代到第十代中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述B组分为含有杂原子配位的Pincer类型配位-双金属配位化合物，由含有杂原子配位的Pincer类型配体和金属离子得到；
7.根据权利要求2或3所述的检测试剂，其特征在于
8.权利要求1～7任一项所述检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Pincer类型配体溶液的制备方法为：将胺类化合物、多聚甲醛和第一溶剂混合进行曼尼希反应；将所得反应产物和N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸进行第一酰胺化反应；将所得产物纯化后与二氯甲烷和三氟乙酸混合进行脱除保护基反应；将所得反应产物和含酸酐二氯甲烷溶液进行第二酰胺化反应，得到羧基封端的四臂胺化合物；将所述羧基封端的四臂胺化合物、二甲基亚砜、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合进行第三酰胺化反应，得到Pincer类型配体溶液。
10.权利要求1～7任一项所述检测试剂或权利要求8～9所述制备方法得到的检测试剂在制备检测含有N-磷酸化修饰的生物分子的试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种n-磷酸化修饰生物分子的检测试剂，其特征在于，包括pincer类型双金属官能化树枝状聚合物；所述官能化树枝状聚合物由包括a组分和b组分的原料制备得到；
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述官能化树枝状聚合物还键合有c组分，所述c组分为可实现直接检测的官能团或可实现直接检测的抗体基团。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述官能化树枝状聚合物还键合有d组分，所述d组分为可与c组分相结合的官能团或可与c组分相结合的抗体基团。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述树枝状聚合物为聚酰胺-胺型树枝状聚合物或聚酰胺-胺型树枝状聚合物的共嵌树枝状聚合物。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物为第二代到第十代中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述b组分为含有杂原子配位的pincer类型配位-双金属配位化合物，由含有杂原子配位的pince...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽媛，
申请(专利权)人：深圳综合粒子设施研究院，
类型：发明
国别省市：
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