【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术生产领域。具体地说，本专利技术涉及一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。其中，嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产中。sauer t等采用“细菌挤奶法”高密度发酵获得了较高产量的四氢嘧啶，即高渗透压下培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质，依次循环多至8-9次，获得产物。朱皖宜(201310416404.4)等公开了一种可用于生产四氢嘧啶的新的盐单胞菌halomonas sp.hs-2255及其突变株，保藏号为cgmccno.6248。该菌株在含有可同化的碳源和氮源且较低的nacl含量的培养基中具有较高的四氢嘧啶产量，并且副产物羟基四氢嘧啶的含量较低。
2、酶催化法是通过在大肠杆菌中表达四氢嘧啶合成基因簇ectabc以获得具有相应酶活性的全细胞或粗酶液，以天冬氨酸为前体物催化合成四氢嘧啶的过程。董志扬等(201310518176.1，201310534045.2)利用e.coli bw-pbad-ectabc，保藏编号为cgmccno.8334，将l-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。该菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5g，合成效率达到11.67g/l.d。
3、以上两种方法中，嗜盐菌发酵生产四氢嘧啶的不足在于培养过程中均需要高nacl浓度来刺激菌体积累更多的产物，发酵周期较长，而且高浓度的nacl溶液对发酵设备腐蚀严重，不适合
4、因此，本领域需要操作简便，成本低廉，环境友好的四氢嘧啶生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种产生四氢嘧啶的基因工程菌。
2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程益生菌的构建方法。
3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供利用上述基因工程益生菌产生四氢嘧啶的方法。
4、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程益生菌的应用，用于制备四氢嘧啶。
5、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
6、在第一方面，本专利技术提供一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法，所述方法包括：
7、1)增强所述基因工程菌中的ecta、b、c基因；
8、2)弱化所述基因工程菌中的crr、thra、iclr基因；
9、3)增强所述基因工程菌中的天冬氨酸脱氢酶aspdh基因、内源抗反馈抑制的突变基因eclysc*和ppc基因。
10、在优选的实施方式中，所述“增强”是指提高所述基因工程菌本身存在的内源性基因的表达或活性；或者外源性导入所述基因工程菌中本身不存在的基因，并使得所述外源性导入的基因在所述基因工程菌中表达或起作用。
11、在优选的实施方式中，所述“弱化”是指降低所述基因工程菌中一个或多个基因的表达或活性。
12、在优选的实施方式中，所述“弱化”是指经弱化的基因的表达或活性是未弱化的基因的表达或活性的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％；优选使得所述基因完全失活。
13、在优选的实施方式中，所述“弱化的基因的表达或活性”可以通过，例如在所述基因工程菌的培养基中加入抑制剂或者敲除所述基因工程菌中的基因来实现。
14、在具体的实施方式中，所述ecta、b、c基因来源于伸长盐单胞菌；所述aspdh基因和突变基因eclysc*来源于铜绿假单胞菌；所述ppc基因来源于大肠杆菌。
15、在具体的实施方式中，所述基因ecta的序列如seq id no:1所示；
16、所述基因ectb的序列如seq id no:2所示；
17、所述基因ectc的序列如seq id no:3所示；
18、所述基因crr的序列如seq id no:4所示；
19、所述基因thra的序列如seq id no:5所示；
20、所述基因iclr的序列如seq id no:6所示；
21、所述基因aspdh的序列如seq id no:7所示；
22、所述基因ppc的序列如seq id no:8所示；
23、所述基因eclysc*的序列如seq id no:9所示。
24、在具体的实施方式中，所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株；
25、优选地，所述菌株为埃希氏菌属(escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)；优选大肠杆菌；更优选e.coli nissle 1917。
26、在优选的实施方式中，所述菌株本身具有产生四氢嘧啶的能力。
27、在优选的实施方式中，所述天冬氨酸脱氢酶aspdh基因和内源抗反馈抑制的突变基因eclysc*受j23119启动子控制；所述ppc基因受j23115启动子控制。
28、在优选的实施方式中，所述j23119启动子的序列如seq id no:10所示；所述j23115启动子的序列如seq id no:11所示。
29、在优选的实施方式中，所述方法构建的基因工程菌产生四氢嘧啶的产量为70g/l或更高以上。
30、在第二方面，本专利技术提供一种基因工程菌，所述基因工程菌中ecta、b、c基因得到增强；crr、thra、iclr基因得到弱化；天冬氨酸脱氢酶aspdh基因、内源抗反馈抑制的突变基因eclysc*和ppc基因得到增强。
31、在具体的实施方式中，所述ecta、b、c基因来源于伸长盐单胞菌；所述aspdh基因和突变基因eclysc*来源于铜绿假单胞菌；ppc基因来源于大肠杆菌。
32、在具体的实施方式中，所述基因ecta的序列如seq id no:1所示；
33、所述基因ectb的序列如seq id no:2所示；
34、所述基因ectc的序列如seq id no:3所示；
35、所述基因crr的序列如seq id no:4所示；
36、所述基因thra的序列如seq id no:5所示；
37、所述基因iclr的序列如seq id no:6所示；
38、所述基因aspdh的序列如seq id no:7所示；
39、所述基因ppc的序列如seq id no:8所示；
40、所述基因eclysc*的序列如seq id no:9所示。
41、在具体的实施方式中，所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株；
42、优选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌；所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌；所述ppc基因来源于大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示；
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株；
5.一种基因工程菌，所述基因工程菌中ectA、B、C基因得到增强；crr、thrA、iclR基因得到弱化；天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因得到增强。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌；所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌；ppc基因来源于大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示；
8.如权利要求
9.权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的基因工程菌，或者权利要求5-8中任一项所述的基因工程菌在制备四氢嘧啶中的用途。
10.一种四氢嘧啶的制备方法，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ecta、b、c基因来源于伸长盐单胞菌；所述aspdh基因和突变基因eclysc*来源于铜绿假单胞菌；所述ppc基因来源于大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因ecta的序列如seq id no:1所示；
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株；
5.一种基因工程菌，所述基因工程菌中ecta、b、c基因得到增强；crr、thra、iclr基因得到弱化；天冬氨酸脱氢酶aspdh基因、内源抗反馈抑制的突变基因ecl...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏嘉士，张宝琪，吕齐，
申请(专利权)人：百开盛上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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