【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器及其构建方法，还涉及一种所述传感器配合商业化早孕试纸实现肉毒杆菌神经毒素a检测方法，属于生物传感。
技术介绍
1、肉毒杆菌神经毒素(bonts)是肉毒杆菌在繁殖过程中分泌的一种毒性蛋白质。依其毒性和抗原性不同，分为a、b、c、d、e、f、g、x8个亚型。目前，主要是a、b型被开发进入商业化运用，其中a型效力最强。因在临床中发现，肉毒杆菌神经毒素在消除皱纹方面具有显著的功效。很快，注射肉毒杆菌神经毒素的美容手术应运而生，并迅速风靡全球。然而由于神经毒性强烈，肉毒杆菌神经毒素产品在各个国家均按照药品标准受到严格管控。《柳叶刀》1978年刊登的一项研究数据显示，a型肉毒素对人类的致死剂量为1纳克(约2000～3000个单位)/千克体重。因此临床上迫切需要开发快速、准确的检测肉毒杆菌神经毒素的方法。
2、目前小鼠生物检测法仍然是检测肉毒杆菌神经毒素的金标准，但存在耗时(4～6天)及费用高等问题。因此，开发一种操作处理简单，选择性好，灵敏度高，成本低廉的肉毒杆菌神经毒素检测方法具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有检测肉毒杆菌神经毒素的方法存在的不足，本专利技术的目的是在于提供一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器，该生物传感器为fe3o4-peptide-hcg复合物，利用特殊的多肽链将hcg固定在磁珠表面，而多肽链可以被肉毒杆菌神经毒素a切割释放hcg分子，从而可以利用商业早孕试纸来检测肉毒杆菌神经毒素a。>
2、本专利技术的第二个目的是在于提供一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，该方法简单，成本低，操作方便，有利于扩大生产。
3、本专利技术的第三个目的是在于提供一种肉毒杆菌神经毒素a的检测方法，该方法利用fe3o4-peptide-hcg复合物配合商业化早孕试纸实现，具有选择性好、灵敏度高、操作简单方便、成本低等优点，可以实现肉毒杆菌神经毒素a的定量分析。
4、为了实现上述技术目的，本专利技术提供了一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器，其包括fe3o4-peptide-hcg复合物；所述fe3o4-peptide-hcg复合物由hcg通过多肽链修饰在fe3o4磁珠上构成；所述多肽链序列为csnktr idqanqratkmlk。
5、本专利技术用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器为fe3o4-peptide-hcg复合物。其设计原理主要是：hcg能够使得商业早孕试纸变色，同时设计特殊的多肽链序列csnktridqanqratkmlk，其能够被肉毒杆菌神经毒素a切割，且对检测过程没有干扰。基于此，先在磁珠表面修饰特殊的多肽链，而再利用多肽链的自由端修饰hcg分子，而在肉毒杆菌神经毒素a存在下，肉毒杆菌神经毒素a可以将多肽链切割，释放固定在磁珠表面的hcg，此时通过磁铁将磁珠分离后，溶液中的hcg使早孕试纸显色，而当没有肉毒杆菌神经毒素a存在时，hcg固定在磁珠上而未被释放，将磁珠分离后，溶液中不含hcg分子，所以早孕试纸不会显色。由此，可以实现肉毒杆菌神经毒素a的检测，并且溶液中肉毒杆菌神经毒素a的含量与释放的hcg量呈现正比关系，通过检测hcg含量的高低可以实现肉毒杆菌神经毒素a的定量分析。
6、本专利技术还提供了一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，其包括以下步骤：
7、1)将表面带氨基的磁珠、戊二醛及硫氰酸钾在溶液中混合孵育i，得到表面氨基活化的磁珠；
8、2)将表面氨基活化的磁珠与多肽进行缩合反应，得到多肽修饰的磁珠；所述多肽一端修饰巯基一端修饰氨基；
9、3)将多肽修饰的磁珠与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应i，得到反应液i；同时，将hcg溶液与4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液进行反应ii，得到反应液ii；将反应液i和反应液ii混合孵育ii，磁选分离，即得fe3o4-peptide-hcg复合物。
10、本专利技术提供的fe3o4-peptide-hcg复合物的制备方法，该方法利用磁珠来作为载体，一方面，有利于磁珠从溶液中分离，另外一方面，能提高多肽及hcg在磁珠表面的负载量，提高检测灵敏度。利用的多肽其一端修饰有氨基，另一端修饰有巯基，磁珠表面的氨基与多肽上的氨基可以通过戊二醛缩合，从而实现交联，能够将多肽修饰在磁珠表面，而多肽另一端的巯基与hcg分子上的氨基通过smcc交联，而多肽能够响应肉毒杆菌神经毒素a从而释放hcg，从而构建肉毒杆菌神经毒素a的生物传感器。
11、作为一个优选的方案，所述孵育i的条件为：在室温下，孵育2～3小时。通过孵育能够将磁珠表面的氨基与戊二醛发生缩合，从而得到醛基修饰的磁珠。
12、作为一个优选的方案，所述缩合反应的条件为：在室温下，反应6～8小时。通过缩合反应可以将多肽通过化学键合至磁珠表面。
13、作为一个优选的方案，所述反应i的条件为：在室温下，反应1～2小时。该反应主要是将多肽上的巯基活化。
14、作为一个优选的方案，所述反应ii的条件为：在在室温下，反应30～60min。该反应主要是将hcg分子上的氨基活化。
15、作为一个优选的方案，所述孵育ii的条件为：在0～5℃，反应8～12小时。孵育过程能够将活化的巯基和活化的氨基进行缩合反应。
16、作为一个优选的方案，所述多肽链序列为hs-csnktridqanqra tkmlk-nh2(于生工生物工程(上海)股份有限公司购得)。
17、作为一个优选的方案，步骤1)中，所述磁珠在溶液中的浓度为2～5mg/ml。磁珠的浓度过小将导致负载的hcg量偏少，影响检测灵敏度。而磁珠浓度过大一方面会影响多肽和hcg在磁珠表面的负载效率，另一方面也会影响到肉毒杆菌神经毒素a切割多肽的效率，进而影响检测灵敏度。
18、本专利技术还提供了一种肉毒杆菌神经毒素a检测的方法，该方法是将肉毒杆菌神经毒素a溶液与含所述fe3o4-peptide-hcg复合物的溶液混合反应后，磁选分离，反应液采用商用早孕试纸检测。
19、作为一个优选的方案，所述反应的条件为在20～40℃，反应2～3小时。
20、作为一个优选的方案，采用商用早孕试纸检测反应液的过程为：将早孕试纸浸入反应液中5～20分钟后，取出并早孕试纸拍照并用imagej软件分析试纸显色强度。
21、作为一个优选的方案，根据早孕试纸测试线颜色深浅肉眼判断肉毒杆菌神经毒素a浓度大小，颜色越深，肉毒杆菌神经毒素a的浓度越大；或者，通过imagej软件分析颜色深浅，实现肉毒杆菌神经毒素a定量检测。
22、本专利技术的fe3o4-peptide-hcg复合物用于检测肉毒杆菌神经毒素a的方法：
23、1)将不同浓度的肉毒杆菌神经毒素a溶液与fe3o4-peptide-hcg复合物孵育，用磁铁将磁珠分离后，将早孕试纸浸入溶液中反应，随后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于肉毒杆菌神经毒素A检测的生物传感器，其特征在于：
2.权利要求1所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素A检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素A检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素A检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述多肽链序列为HS-CSNKTRIDQANQRATK MLK-NH2。
5.一种肉毒杆菌神经毒素A检测的方法，其特征在于：将肉毒杆菌神经毒素A溶液与含权利要求1所述Fe3O4-peptide-HCG复合物的溶液混合反应后，磁选分离，反应液采用商用早孕试纸检测。
6.根据权利要求5所述的一种肉毒杆菌神经毒素A检测的方法，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的一种肉毒杆菌神经毒素A检测的方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的一种肉毒杆菌神经毒素A检测的方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器，其特征在于：
2.权利要求1所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述多肽链序列为hs-csnktridqanqratk mlk-nh2。...
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