【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，特别涉及一种来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白及其在羊冷冻精液稀释液中的应用
技术介绍
1、冷冻保存技术可以对动物精子、胚胎和各种细胞进行长期的贮存，这项技术在动物繁殖育种和人类生殖医学中都有广泛应用，对保存物种的种质资源和发展动物繁殖技术的商业价值有着重要的意义。虽然早在1949年就有了使用甘油等抗冻保护剂改善精子冷冻效果的相关研究，但直至目前冻融过程对精子造成的明显致死性和亚致死性损伤依然限制着其使用效果。冻融过程中冰晶的产生和消失会使精子处于低渗和高渗的胁迫中，渗透胁迫导致精子加速衰老甚至死亡，并且使存活精子的氧化还原调节和代谢失衡，渗透胁迫破坏线粒体膜，线粒体功能失衡产生过量ros，使细胞和细胞器膜中的脂质氧化成脂质过氧化物，并且还会导致精子蛋白质与dna变性，此外非致死的精子损伤可能会影响后代。
2、羊冷冻精液的研究起始于20世纪30年代，但到目前为止仍未形成高效稳定的程序化冷冻技术。究其原因，羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力；虽然用于冷冻的精液要求冷冻前活率达到0.8以上，但因不同公羊个体差异所产生的精子活力不同，精子冷冻效果很不稳定，有效精子少，活力低，质量差，无法进行批量生产。虽然有关于冷冻保护液的研究，但是现有的精子冷冻保存液以精子稀释液作为基础组分，精子稀释液通常为平衡盐溶液，还另外加入抗冻剂(甘油、dmso和甲醇等)和/或营养组分(脱脂奶粉、卵黄、蛋白质和糖类等)，来保护精子在温度剧烈变化过程中其内部结构的完整性和活力。但是外加的
3、精子冷冻蛋白质组学的目的是为了揭示精子冷冻伤害的分子机制，寻找影响精子活力和受精能力的关键蛋白质，优化精子冷冻保存技术，提高人工授精的效率和成功率。精子冷冻蛋白质组学的研究对象可以是不同物种，不同品种，不同处理条件下的精子样本。同种动物不同个体精子抗冻性有优劣之分，通过对比抗冻性好(gfe)和抗冻性差(pfe)的精子之间蛋白质丰度的差异，可以进行抗冻标记蛋白和抗冻标记基因的筛选。虽然近年来，很多学者对不同动物开展了抗冻标记蛋白的研究，发现了一些与精子形态和功能相关的蛋白质。但是目前关于羊精液的抗冻性标记蛋白的研究较少，而且也并没有真正的应用性的研究成果。并没有相应的应用可以运用在精液冷冻的实践中。
技术实现思路
1、本专利技术为了解决现有羊冷冻精液活率和活力低且冷冻效果不稳定的问题，提供了一种来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白及其在羊冷冻精液稀释液中的应用。
2、具体而言，本专利技术首先提供一种来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白，所述蛋白通过不同样本间精子蛋白鉴定后，使用go注释，kegg通路，ppi网络等分析方法，根据蛋白质的生物学功能，参与的代谢途径，相互作用关系等进行分析等手段获得，所述蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.1所示。
3、进一步的，本专利技术提供了一种抗冻蛋白，在seq id no.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或多个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。
4、进一步的，本专利技术提供了一种抗冻蛋白的应用，所述应用为制备一种羊冷冻精液稀释液。
5、优选的，所述一种羊冷冻精液稀释液包括如下组分：
6、基础冷冻液(100ml)：3g葡萄糖,4.8g乳糖,1.6g柠檬酸钠,100iu/l(终浓度)抗菌剂。
7、ⅰ液：在基础冷冻液中加入1-10ml上述羊抗冻蛋白(1mg/ml，溶于0.01mpbs)，
8、ⅱ液：ⅰ液中加入总体积6％的％甘油。
9、其中，抗菌剂选自青霉素、庆大霉素、两性霉素b、青霉素-链霉素中的一种或多种；
10、优选的，所述羊冷冻精液稀释液中，还可以包括甘露醇和/或二糖，其中二糖选自蔗糖，海藻糖和蔗糖与海藻糖的混合物。进一步优选的，羊冷冻精液稀释液还可以包含约1％甘露醇，约1％二糖，其中二糖选自蔗糖，海藻糖和蔗糖与海藻糖的混合物。
11、优选的，所述羊冷冻精液稀释液中，还可以包括维生素c和/或谷胱甘肽，进一步优选的，羊冷冻精液稀释液包含，维生素c 0.2～0.4g，谷胱甘肽0.02～0.04g；
12、优选的，所述羊冷冻精液稀释液中，还可以包括三磷酸腺苷，进一步优选的，羊冷冻精液稀释液包含，三磷酸腺苷0.08～0.09g。
13、进一步的，本申请提供一种羊冷冻精液稀释液在羊精液保存中的应用，所述应用为：采用所述羊冷冻精液稀释液进行精液的冷冻保存。
14、本领域技术人员可以理解，利用上述试剂进行羊精液的常温保存、低温保存；进行其他动物精液的常温保存、低温保存、冷冻保存均属于本专利技术的保护范围。
15、本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种超高活力羊精液冷冻保藏方法包括如下步骤：
16、(1)稀释步骤：按照常规山羊精液稀释浓度计算所需冷冻液总量。加入所需总体积一半体积的ⅰ液对新鲜精液进行稀释，4℃平衡2h，再加入与ⅰ液等体积的ⅱ液，4℃
17、平衡2h，再进行冷冻，冷冻24h后进行如下冻精质量检测。
18、(2)用镊子将冻精细管从液氮中取出后暴露于空气1～2s，投入恒温水浴锅中38℃
19、水浴30s，37℃孵育5min。
20、有益效果
21、本专利技术通过精子冷冻蛋白质组学筛选获得了一种来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白，在冷冻保存液中添加上述蛋白，可显著提高山羊精子冷冻解冻后的过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性(p<0.05)，显著增强精子的总抗氧化能力(p<0.05)，显著降低精子细胞内活性氧水平与丙二醛含量(p<0.05)。同时，用本专利技术所述的精液保存液可以有效去除“衰老”精子、弱死精子和精液中非必需物质及有害物质从而获得高活力精子，精液冷冻前的活率为0.8以上，解冻后活率为0.65-0.75，完全满足羊冷冻精液人工授精的要求，大幅度提高了解冻后精子的活率与活力并保证了精子解冻后活率与活力的稳定性；提高了羊冷冻精液人工授精的妊娠率，大大提高了冷冻精液的质量。而且由于保存液中不需要添加外源的抗冻蛋白，在保证精子代谢的必需营养物质的同时减少了外源物质对精子造成的损伤和带来的污染风险。本专利技术的抗冻蛋白和冷冻试剂解决了现有羊冷冻精液解冻后活率和活力低，且冷冻效果不稳定的问题，可广泛适用于羊批量生产中。
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1.一种来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白，其特征在于所述抗氧化抗冻蛋白通过不同样本间精子蛋白鉴定后，使用GO注释，KEGG通路，PPI网络等分析方法，根据蛋白质的生物学功能，参与的代谢途径，相互作用关系等进行分析获得，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.如权利要求1中所述的来源于羊自身的抗氧化抗冻蛋白的应用，所述应用为制备一种羊冷冻精液稀释液。
3.一种羊冷冻精液稀释液，其特征在于所述羊冷冻精液稀释液包括如下组分：
4.如权利要求3所述的一种羊冷冻精液稀释液，其中抗菌剂选自青霉素、庆大霉素、两性霉素B、青霉素-链霉素中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的一种羊冷冻精液稀释液，所述羊冷冻精液稀释液中，还包括约1％甘露醇，约1％二糖，其中二糖选自蔗糖，海藻糖和蔗糖与海藻糖的混合物；维生素C 0.2～0.4g，谷胱甘肽0.02～0.04g；三磷酸腺苷0.08～0.09g。
6.一种如权利要求3-5之一所述的羊冷冻精液稀释液在羊精液保存中的应用，所述应用为：采用所述羊冷冻精液稀释液进行精液的冷冻保存。
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