【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及计分子生物学，具体涉及一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞株及其构建方法与应用。
技术介绍
1、jak2基因突变或融合是mpn发生和发展的重要原因，最常见突变类型为jak2v617f。在真性红细胞增多症（pv）患者中jak2 v617f发生率71.4%-96%，原发性血小板增多症（et）为30%-86%，原发性骨髓纤维化（pmf）为40%-80%。jak2突变在mpn发病机制中起到重要作用，伴有jak2突变的患者往往预后不良。
2、jak2基因位于染色体9p24, 编码的jak2蛋白为细胞内酪氨酸激酶, jak2与jak2-stat信号转导途径的调控在维正常造血中起重要作用。当jak2为野生型时，需要细胞外配体（如epo、tpo、gm-csf、il-3）刺激，才能激活jak2-stat，pi3k, ras-mapk信号转导途径，调节正常细胞增殖和分化。当jak2发生突变或融合时，不需要细胞外配体，可持续激活jak2-stat等信号通路，导致骨髓增殖性肿瘤(mpn)的发生。针对骨髓纤维化（mf）的发病机理，jak2为重要的治疗靶点，药企开发了一系列jak2选择性和非选择性抑制，对于提高了存活率，改善了疾病相关症状，包括白细胞减少、红细胞比容、脾肿大和骨髓纤维化等具有积极意义。
3、但是目前还没有合适的方法用于测定jak2激酶抑制剂生物学活性。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞
2、针对上述技术问题，提出一种一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞株；通过以下技术方案实现的：一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞株的构建方法，包括以下步骤：
3、（1）如seq id no:1所示的jak2 v617f和如seq id no:2所示tel-jak2基因合成；
4、（2）将扩增的jak2 v617f和tel-jak2基因分别构建到plvx-puro载体，构建质粒plvx-jak2 v617f-puro和plvx-tel-jak2-puro；
5、（3）将plvx-jak2 v617f和plvx-tel-jak2-puro质粒分别转染至ba/f3细胞，得到ba/f3 jak2 v617f细和ba/f3-tel-jak2细胞 ，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行wb鉴定，获得稳定细胞株。
6、ba/f3是一个il3依赖的原b细胞，在导入和表达jak2 v617f激酶，该细胞不再依赖il3,细胞增殖完全有jak2 v617f蛋白驱动，当加入jak2抑制剂，jak2 v617f蛋白的激酶活性被抑制，则细胞增殖会被抑制。
7、本专利技术还提供了一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性的细胞株，所述稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性的细胞株通过上述的制备方法得到稳定细胞株ba/f3 jak2v617f细胞和ba/f3-tel-jak2细胞。
8、本专利技术还提供一种测定jak2激酶抑制剂生物学活性的方法，其特征在于，将权利要求2所述的稳定细胞株ba/f3 jak2 v617f细胞和ba/f3-tel-jak2细胞分别用细胞培养基培养至在一定细胞密度的情况下接种到96孔细胞培养板，加入梯度稀释的jak2激酶抑制剂，继续培养，检测细胞增值的情况，建立细胞增殖与jak2激酶抑制剂生物学的量效关系。
9、优选地，所述的测定方法，包括以下步骤：
10、a）将稳定细胞株ba/f3 jak2 v617f细胞和ba/f3-tel-jak2细胞分别重悬于完全培养基中，细胞密度为2.5*10e4/ml；
11、b）将重悬细胞按100ul/孔细胞悬液接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中；
12、c）用完全培养基梯度稀释jak2激酶抑制剂，分别加入96孔板，继续培养72小时；
13、d）每孔加入100ul celltiter-glo试剂，读取各孔的化学发光强度，并对测定的数据进行处理，计算待测样品的半数有效浓度gi50。
14、jak2激酶抑制剂包括有ruxolitinib，fedratinib，jaktinib或tq05105 。
15、本专利技术与现有技术相比具有的有益效果是：本专利技术了构建的细胞准能够稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞株， 该方法简单、快速、高效、特异性、低成本效，一方面与传统酶学方法相比细胞水平的检测方法更接近体内生理状态下化合物的药效水平；另一方面与动物实验和临床实验项目，实验周期和成本会有极大的降低。
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1.一种稳定测定JAK2激酶抑制剂生物学活性细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.一种稳定测定JAK2激酶抑制剂生物学活性的细胞株，其特征在于，通过权利要求1所述的制备方法得到稳定细胞株BA/F3 JAK2 V617F细胞和BA/F3-Tel-JAK2细胞。
3.一种测定JAK2激酶抑制剂生物学活性的方法，其特征在于，将权利要求2所述的稳定细胞株BA/F3 JAK2 V617F细胞和BA/F3-Tel-JAK2细胞在一定细胞密度的情况下分别接种到96孔细胞培养板，加入梯度稀释的JAK2激酶抑制剂，继续培养，检测细胞增值的情况，建立细胞增殖与JAK2激酶抑制剂生物学的量效关系。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.一种稳定测定jak2激酶抑制剂生物学活性的细胞株，其特征在于，通过权利要求1所述的制备方法得到稳定细胞株ba/f3 jak2 v617f细胞和ba/f3-tel-jak2细胞。
3.一种测定jak2激酶抑制剂生物学活性的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵悦，蒋涛华，傅坚刚，
申请(专利权)人：南京科佰基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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