【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞培养，涉及一种无血清间充质干细胞三维培养基。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
的信息旨在增加对本专利技术总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，msc）是一种源于中胚层的多能干细胞，能够无限制自我更新，多向分化。在合适的条件下，能在体外或者体内定向分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等等，作为组织修复的种子细胞。mscs免疫原性较低，不易引起机体的排斥反应；具有分化成其他中胚层细胞的潜能，能够分泌多种细胞因子；具有定向迁移能力。在器官移植时使用，可以降低免疫排斥，提高移植的成功率，同时加快手术创口的恢复。mscs具有的这些优良特性使之在受损组织修复、组织工程、造血干细胞、器官移植、自体免疫性疾病治疗中具有广泛的应用前景。
3、在细胞组织领域的研究中，大量细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养实现。传统的含动物血清的细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素，由于批间差异大，血清来源成分不稳定，而且价格昂贵，成分不明确，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的添加剂两部分组成，能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足体外细胞培养的要求。
4、进行间充质干细胞规模化扩增的主要方式是大规模二维细胞瓶培养，然而这种传统的培养方式使用大量细胞培养瓶增加了成本、容易污染，且这种传统的二维培养方式要求严格控制细胞密度，容易影响细胞质量和产量。
5、传统的三维培养需要用网状支架或悬浮的微球作为载体，使干细胞在其表面附着生长。这些支架大多由高分子材料构成，具有一定的刚性结构，不可降解或降解缓慢，增加了细胞接种培养和回收的操作难度，而且载体材料的制作成本较高，涉及的合成工艺易产生毒性和免疫反应，影响细胞的质量。因此提供一种成分较简单、组分确定、防止细胞贴壁、细胞增殖速率高的无血清三维培养基以提高间充质干细胞的体外三维培养的效率具有重要意义。
技术实现思路
1、针对目前间充质干细胞三维培养中的问题，本专利技术提供一种无血清间充质干细胞培养基，成分确定、质量可靠，无动物血清成分，无异源蛋白污染；无需三维载体，后处理简单，适于规模化生产制备间充质干细胞。
2、本专利技术的另一目的是提供一种间充质干细胞三维培养的方法。
3、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
4、一种无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
5、人血小板裂解液 5%-25%（v/v），胶原蛋白 100-1000mg/l，纤连蛋白 100-1000mg/l，β-烟酰胺单核苷酸（nmn）0.1-10mg/l，重组人干扰素-γ（ifn-γ）1-100μg/l，肿瘤坏死因子-α（tnf-α）1-100μg/l，重组人表皮生长因子（egf）1-50μg/l，重组血管内皮生长因子（vegf）1-50μg/l，重组人血小板衍生生长因子（pdgf）1-50μg/l，重组人转化生长因子β1（tgf-β1）1-50μg/l，胰岛素 1-10u/ml，黄体酮 1-50mg/l，地塞米松 1-50nm，亚油酸 50-500mg/l，亚硒酸钠 1-100mg/l，腐胺 1-20mg/l，卵磷脂 1-50μg/l，l-谷氨酰胺 1-10mm，谷胱甘肽 0.5-2mg/l，转铁蛋白 1-100mg/l，维生素c 1-100mg/l，维生素e 1-100mg/l，维生素b1 1-20mg/l，维生素b2 1-20mg/l，维生素b6 1-20mg/l。
6、优选地，上述无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
7、人血小板裂解液 5%-20%（v/v），胶原蛋白 300-1000mg/l，纤连蛋白 500-700mg/l，nmn 2-10mg/l，ifn-γ 20-50μg/l，tnf-α 20-100μg/l，egf 10-30μg/l，vegf 10-30μg/l，pdgf 10-30μg/l，tgf-β1 10-30μg/l，胰岛素 3-8u/ml，黄体酮 5-20mg/l，地塞米松 5-30nm，亚油酸 50-300mg/l，亚硒酸钠 20-60mg/l，腐胺 5-20mg/l，卵磷脂 10-30μg/l，l-谷氨酰胺 3-8mm，谷胱甘肽 1-2mg/l，转铁蛋白 50-60mg/l，维生素c 60-100mg/l，维生素e50-100mg/l，维生素b1 5-20mg/l，维生素b2 5-10mg/l，维生素b6 5-10mg/l。
8、更为优选地，无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
9、人血小板裂解液 15%（v/v），胶原蛋白 500mg/l，纤连蛋白 500mg/l，nmn 2mg/l，ifn-γ 50μg/l，tnf-α 50μg/l，egf 10μg/l，vegf 10μg/l，pdgf 10μg/l，tgf-β1 10μg/l，胰岛素 5u/ml，黄体酮 10mg/l，地塞米松 20nm，亚油酸 100mg/l，亚硒酸钠 50mg/l，腐胺5mg/l，卵磷脂 20μg/l，l-谷氨酰胺 5mm，谷胱甘肽 1mg/l，转铁蛋白 50mg/l，维生素c60mg/l，维生素e 50mg/l，维生素b1 10mg/l，维生素b2 10mg/l，维生素b6 10mg/l。
10、所述基础培养基选自dmem、dmem/f12、advanced dmem/f12、mem培养基、imdm培养基、ham’s f-12k培养基或rpim1640培养基。上述培养基可以根据需要选择葡萄糖的浓度配制为高糖或低糖基础培养基。
11、一种三维培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
12、（1）将间充质干细胞接种至上述无血清间充质干细胞三维培养基中，搅拌培养；
13、（2）培养至一定扩增倍数，将培养液稀释后，按照步骤（1）的接种密度分装并传代培养；
14、（3）按照步骤（1）和（2）的方法扩增培养。
15、所述间充质干细胞的来源并不限定，可以来源于任何可分离间充质干细胞的组织、器官，如：骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、尿液等。为了保证获取的数量，可以选择骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪，血液可以选择脐带血或外周血。
16、所述间充质干细胞可以是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的。一般的，现有技术中，干细胞可传代至15次左右仍能够保持较好的医学本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
2.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
3.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
4.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基或RPIM1640培养基。
5.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基根据需要选择葡萄糖的浓度，配制为高糖或低糖基础培养基。
6.一种三维培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的来源于骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤或尿液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，接种的密度为每毫升104-106；扩增倍数为30-150倍。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，接种密度为5×104-105/mL；搅拌速度为30-60转/分钟；
...【技术特征摘要】
1.一种无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
2.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
3.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
4.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基选自dmem、dmem/f12、advanced dmem/f12、mem培养基、imdm培养基、ham’s f-12k培养基或rpim1640培养基。
5.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小盾，戴晓宇，李栋，刘娅，
申请(专利权)人：泉美智能科技山东有限公司，
类型：发明
国别省市：
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