【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及樟科植物育种，具体涉及闽楠原生质体的制备方法及其在单细胞测序中的应用。
技术介绍
1、闽楠，中国特有，是国家二级珍稀渐危种。闽楠为樟科常绿大乔木，分布于中亚热带常绿阔叶林地带的江西、福建、浙江南部、广东、广西等地。闽楠木材芳香耐久，淡黄色，材质致密坚韧，不易反翘开裂，易加工，削面光滑，纹理美观，为上等建筑、家具、造船及工艺雕刻等良好木材，同时，其树体高大，四季翠绿，是园林绿化优良树种。可见，闽楠具有极高的经济价值、社会价值、生态价值、观赏价值。但闽楠现存资源极少，保护和扩繁优异种质资源成为该种研究的热点与重点。
2、原生质体没有细胞壁，且具有全能性，是进行细胞壁再生、细胞分裂、摄入外源dna、膜透性和信号转导等研究的理想材料；近年来，原生质体被用来研究光信号、胁迫和激素作用及调节机制等。利用原生质体获得目的基因瞬时表达体系，具有检测快速、通量高等特点，结合报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、亚细胞定位、启动子及蛋白互作等基因功能分析研究。原生质体在转基因、林木新品种改良、基因功能研究及蛋白互作等方面具有广阔的应用前景。
3、原生质体的研究最早起源于1892年通过机械法从水剑叶(statiotes aloides)叶片中获得，直到1960年，有研究利用酶解法从番茄根尖分离出大量有活力的原生质体，原生质体的制备和分离研究才真正开始。目前，拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米等模式植物和粮食作物的原生质体分离技术已经非常完善，且该技术的应用领域在不断拓宽。
4、1972年有研究利
5、因此，需要开发一种闽楠原生质体的制备方法及其在单细胞测序中的应用方案改善以上问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供闽楠原生质体的制备方法及其在单细胞测序中的应用，以改善以茎为材料的原生质体制备的研究较少以及茎的细胞壁解离更加困难的问题，同时为珍贵树种茎的原生质体的制备提供思路和方法；同时通过单细胞测序，构建闽楠幼茎的细胞图谱，可为樟科及其他木本植物分化发育研究提供全新的见解。
2、一方面，本专利技术提供一种闽楠原生质体的制备方法，包括以下步骤：
3、使用酶解液酶解闽楠1-2月幼茎研磨液，制得闽楠原生质体粗液；所述酶解液包括0.5-0.7mol/l甘露醇、1-2％纤维素r-10、1-2％离析酶r-10；所述酶解时间为3-12h；
4、将原生质体粗液过筛，并加入wb液，重悬并进行第一次离心；第一次离心完成后，弃上清，加入wb液，再重悬并进行第二次离心；第二次离心完成后，弃上清，加入wb液；
5、重复所述第一次离心的步骤和第二次离心的步骤；完成重复后，加入wb液混匀，制得闽楠原生质体悬液。
6、可选地，使用酶解液酶解闽楠1-2月幼茎，制得闽楠原生质体粗液步骤前需执行以下步骤：加入1-1.5ml甘露醇溶液，0.1-0.15ml巯基乙醇和0.15-0.2g聚乙烯吡咯烷酮至所述闽楠1-2月幼茎中，研磨后制得闽楠幼茎研磨液。
7、可选地，将原生质体粗液过筛步骤中，过筛时的筛网为40μm细胞筛。
8、可选地，wb液的组成包括：0.5-0.7mg/ml甘露醇、0.03％-0.04％牛血清白蛋白、0.85-0.88mg/ml维生素c、0.02-0.03g/ml尿素。
9、可选地，将原生质体粗液过筛，并加入wb液，重悬并进行第一次离心步骤中，所述第一次离心的条件为：转速为150×g，时间为5min。
10、可选地，第一次离心完成后，弃上清，加入wb液，再重悬并进行第二次离心步骤中，所述第二次离心的条件为：转速为150×g，时间为3min。
11、另一方面，本专利技术提供闽楠原生质体的应用，包括以下步骤：
12、通过所述闽楠原生质体悬液制备单细胞油滴，收集合格的所述单细胞油滴进行反转录；
13、所述反转录结束后，将所述油滴去除并进行mrna纯化；
14、所述mrna纯化完成后进行cdna的扩增和纯化；
15、所述cdna的扩增和纯化完成后，构建3’端基因表达文库，并进行单细胞测序；
16、所述单细胞测序完成后，对测序结果进行分析，并进行闽楠细胞亚群的分类。
17、可选地，通过所述闽楠原生质体悬液制备单细胞油滴步骤中，所述闽楠原生质体悬液的浓度为(1-2)×106cells/ml。
18、可选地，收集合格的所述单细胞油滴进行反转录步骤中，所述反转录的条件为53℃，45min，85℃，5min。
19、可选地，所述cdna的扩增和纯化完成后，构建3’端基因表达文库，并进行单细胞测序步骤中，所述单细胞测序的平台为illumina hiseq2000。
20、本专利技术具备的有益效果包括：
21、(1)本专利技术提供的闽楠原生质体的制备方法，通过机械研磨，使闽楠细胞壁更易被后续的酶降解，研磨时加入巯基乙醇和pvp防止原生质体褐化，降低氧化速度；
22、(2)本专利技术提供的闽楠原生质体的制备方法，通过在wb液中添加尿素和维生素c，提高原生质体稳定性，控制细胞壁损坏的程度，而原生质体不易受到破坏，降低制备过程中原生质体的碎片率；
23、(2)本专利技术提供的闽楠原生质体的制备方法，改善了现有技术中大部分茎的细胞壁解离更加困难的问题，为以茎为材料制备原生质体提供了思路；同时为珍贵树种以茎为材料制备原生质体提供了技术，改善了目前尚未有珍贵树种的原生质体制备的方法这一问题；
24、(3)本专利技术通过提供的闽楠原生质体制备方法制备的闽楠原生质体，满足单细胞测序的要求，具有较高的完整性和较好的活性；在单细胞测序后能够构建闽楠幼茎的细胞图谱，可为樟科及其他木本植物分化发育研究提供全新的见解、思路。
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1.一种可用于单细胞测序的闽楠原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用酶解液酶解闽楠1-2月幼茎，制得闽楠原生质体粗液步骤前需执行以下步骤：加入1-1.5mL甘露醇溶液，0.1-0.15mL巯基乙醇和0.15-0.2g聚乙烯吡咯烷酮至所述闽楠1-2月幼茎中，研磨后制得闽楠幼茎研磨液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛步骤中，过筛时的筛网为40μm细胞筛。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛，并加入WB液，重悬并进行第一次离心步骤中，所述WB液的组成包括：0.5-0.7mol/L甘露醇、0.03％-0.04％牛血清白蛋白、0.85-0.88mg/mL维生素C、0.02-0.03g/mL尿素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛，并加入WB液，重悬并进行第一次离心步骤中，所述第一次离心的条件为：转速为150×g，时间为5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一次离心完成后，弃上清
7.如权利要求1所述的闽楠原生质体的应用，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过所述闽楠原生质体悬液制备单细胞油滴步骤中，所述闽楠原生质体悬液的浓度为(1-2)×1 06cells/mL。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，收集合格的所述单细胞油滴进行反转录步骤中，所述反转录的条件为53℃，45min，85℃，5min。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述cDNA的扩增和纯化完成后，构建3’端基因表达文库，并进行单细胞测序步骤中，所述单细胞测序的平台为Illumina Hiseq2000。
...【技术特征摘要】
1.一种可用于单细胞测序的闽楠原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用酶解液酶解闽楠1-2月幼茎，制得闽楠原生质体粗液步骤前需执行以下步骤：加入1-1.5ml甘露醇溶液，0.1-0.15ml巯基乙醇和0.15-0.2g聚乙烯吡咯烷酮至所述闽楠1-2月幼茎中，研磨后制得闽楠幼茎研磨液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛步骤中，过筛时的筛网为40μm细胞筛。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛，并加入wb液，重悬并进行第一次离心步骤中，所述wb液的组成包括：0.5-0.7mol/l甘露醇、0.03％-0.04％牛血清白蛋白、0.85-0.88mg/ml维生素c、0.02-0.03g/ml尿素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将原生质体粗液过筛，并加入wb液，重悬并进行第一次离心步...
【专利技术属性】
技术研发人员：伍艳芳，郑永杰，刘新亮，张月婷，徐海宁，涂白连，戴小英，温世钫，郭捷，
申请(专利权)人：江西省林业科学院，
类型：发明
国别省市：
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