【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法。
技术介绍
1、角膜是眼球前部的透明组织，对保持眼球形状和聚焦光线至关重要。角膜由五个层次的结构组成，其中基质层占据了角膜厚度的90％。角膜基质由胶原和角膜基质细胞(csks)组成，形成类似于胶原基质的网状结构。这种结构提供支持给角膜上皮细胞和角膜内皮细胞，同时维持角膜的透明性和形状。角膜受到感染、瘢痕、黄斑变性等问题的影响时，可能导致角膜盲，全球约有4000万人受到这些问题的困扰，成为全球卫生挑战。角膜移植是目前角膜盲主要的治疗方法，但依赖于人眼捐赠，角膜严重供应不足。此外，随着社会老龄化加剧，年龄相关的角膜失明患者数量也在增加，许多患者需要等待数年才能获得手术机会。因此，寻找新的角膜来源变得非常必要。
2、细胞治疗和组织工程策略成为有希望的治疗替代方法。最近的研究表明，通过向角膜注射csks，可以进行基质细胞治疗，促进角膜内功能性基质细胞的再生，从而治疗角膜混浊。csks是角膜中非常重要的细胞类型，具有独特的特征。生理状态下的csk呈现为静止细胞和树突状细胞。它们通常表达分化簇34(cd34)、基质晶体蛋白(aldh3a1)和硫酸角质素蛋白聚糖(kspg)，包括lumican、keratocan和mimecan等，这些蛋白有助于维持角膜的透明性。因此，在体外扩增csks可以增加其数量，实现“一位供体供多位受体”的策略，从而大大增加人角膜供体库的规模，有望解决当前由于供体角膜短缺而无法进行角膜移植的问题。
3、
4、到本专利技术出现前，现有的技术方法在培养人csks不容易保持csks的特性，易分化为sfs，从而限制了扩大培养以用于储存和备用目的的能力。基于此，本申请提供了利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法。
技术实现思路
1、为了克服既有方法的缺陷，本专利技术提供了一种利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增方法，也为其在角膜组织工程和细胞治疗中的潜在应用提供可能性。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，步骤包括：
4、(1)提取并培养人原代csks：将角膜透镜浸于青霉素-链霉素的平衡盐溶液中冲洗消毒，置于倒置显微镜下，将透镜剪成组织块后移到培养皿中，使组织块完全侵泡于裂解液中后，将组织块和裂解液收集至离心管中，离心弃除上清；加入pbs重悬后离心弃除上清；将组织块和分离出的细胞收集到培养皿中，培养后离心去除裂解液，用csk完整培养基重悬并加入培养皿中培养；
5、(2)原代人csks传代方法：吸出培养基，用pbs清洗两次；加入细胞解离试剂，室温孵育；加入pbs收集离心弃上清；加入pbs重悬离心弃上清后培养，每2-3天更换一次csk完整培养基。
6、进一步地，所述所述csk完整培养基成分为：在低糖dmem/f-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、igf-1、y-27632、l-ascorbic 2-phosphate、羊膜上清液、热灭活fbs、视黄酸。
7、进一步地，所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜解冻，在冰上用pbs冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油；用无菌镊子向下挤压羊膜排出pbs；；将羊膜放入的细胞培养皿中，用剪刀剪成组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末状；称量羊膜粉末使得每克羊膜粉末加入3ml pbs；旋转器旋转后过滤；取上清液离心，收集干净的上清保存即得羊膜上清液。
8、进一步地，所述平衡盐溶液为含100u/ml青霉素-100u/ml链霉素的平衡盐溶液。
9、进一步地，所述细胞解离试剂为stemprotmaccutasetm细胞解离试剂。
10、进一步地，所述细胞解离试剂加入量为每孔加入200μl/24孔板或400μl/6孔板。
11、进一步地，所述步骤(2)中加入pbs重悬离心弃上清后培养方法为：将弃上清后的材料加入24孔板中，每孔1ml培养基，在温度为37℃、5％co2条件下进行培养。
12、进一步地，还包括原代人csks冻存步骤。
13、进一步地，所述原代人csks冻存步骤包括：吸出培养基，用pbs清洗两次；加入细胞解离试剂；室温孵育后加入pbs后并通过上下移液冲洗孔以分离细胞，将细胞悬液收集后离心弃上清；加入pbs重悬离心弃上清；用csk完全培养基重悬细胞；在细胞悬液中加入dmso，将细胞悬浮液转入冻存管中，置于程序降温盒中于-80℃至少24h；将冻存管置于液氮下长期存放。
14、本专利技术的有益效果在于：
15、第一、本专利技术以透镜为来源分离人csks的方法，用胶原酶i和分散酶消化透镜的ecm成分，然后在低血清含量(0.5％fbs)的csk完全培养基中使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的csks表型；这些细胞具有独特的表型，包括aldh3a1的表达，降低的csks特异性蛋白(角蛋白和蜡样蛋白)的表达，以及不表达成纤维细胞相关蛋白(纤维连接蛋白和十二烷基硫酸钠-c)；
16、第二、本专利技术提供的培养基为低糖dmem/f12和视黄酸的混合物，该种培养基为在低糖dmem/f-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、igf-1、y-27632、l-ascorbic 2-phosphate、羊膜上清液、热灭活fbs、视黄酸；该培养基可以很好的使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的csk表型使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的csk表型。
17、第三、本专利技术建立了一套高效可行的人csks获取的方案，能够得到静止状态、树突状形态的人csks，可以以很小的概率产生成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述所述CSK完整培养基成分为：在低糖DMEM/F-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、IGF-1、Y-27632、L-ascorbic2-phosphate、羊膜上清液、热灭活FBS、视黄酸。
3.根据权利要求2所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜解冻，在冰上用PBS冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油；用无菌镊子向下挤压羊膜排出PBS；；将羊膜放入的细胞培养皿中，用剪刀剪成组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末状；称量羊膜粉末使得每克羊膜粉末加入3mlPBS；旋转器旋转后过滤；取上清液离心，收集干净
4.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述平衡盐溶液为含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液。
5.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述细胞解离试剂为StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂。
6.根据权利要求5所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述细胞解离试剂加入量为每孔加入200μl/24孔板或400μl/6孔板。
7.根据权利要求2所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述旋转器旋转速度为90-110转/分。
8.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入PBS重悬离心弃上清后培养方法为：将弃上清后的材料加入24孔板中，每孔1ml培养基，在温度为37℃、5％CO2条件下进行培养。
9.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，还包括原代人CSKs冻存步骤。
10.根据权利要求9所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述原代人CSKs冻存步骤包括：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入细胞解离试剂；室温孵育后加入PBS后并通过上下移液冲洗孔以分离细胞，将细胞悬液收集后离心弃上清；加入PBS重悬离心弃上清；用CSK完全培养基重悬细胞；在细胞悬液中加入DMSO，将细胞悬浮液转入冻存管中，置于程序降温盒中于-80℃至少24h；将冻存管置于液氮下长期存放。
...【技术特征摘要】
1.一种利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述所述csk完整培养基成分为：在低糖dmem/f-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、igf-1、y-27632、l-ascorbic2-phosphate、羊膜上清液、热灭活fbs、视黄酸。
3.根据权利要求2所述的利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜解冻，在冰上用pbs冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油；用无菌镊子向下挤压羊膜排出pbs；；将羊膜放入的细胞培养皿中，用剪刀剪成组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末状；称量羊膜粉末使得每克羊膜粉末加入3mlpbs；旋转器旋转后过滤；取上清液离心，收集干净的上清保存即得羊膜上清液。
4.根据权利要求1所述的利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述平衡盐溶液为含100u/ml青霉素-100u/ml链霉素的平衡盐溶液。
5.根据权利要求1所述的利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：路平，王雁，邓福麒，单梦圆，季学猛，董益，
申请(专利权)人：天津市眼科医院，
类型：发明
国别省市：
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