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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学基因检测,尤其涉及一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法。
技术介绍
1、tert基因是编码端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,tert)的重要基因之一,端粒酶在正常体细胞中受到严格调控,最重要的限速酶是tert,正常细胞系中无tert表达,而大多数肿瘤细胞通过异常上调tert表达来维持端粒长度。自2002年以来,tert基因突变已被证实广泛分布于肿瘤中,诸如甲状腺癌、黑色素瘤、结肠癌和非小细胞肺癌等。常见的tert基因突变发生在启动子区域,tert启动子区突变将会上调tert mrna和蛋白表达以及端粒长度,甲状腺癌中tert突变常见于启动子区的c228t和c250t位点。因此,tert基因启动子区c228t位点的检测对癌症的诊断、预后和预测具有重要作用。
2、在临床实践中,tert突变主要是基于dna的分析,并利用聚合酶链式反应(英文简称:pcr)进行检测。但是tert基因在启动子区域的突变具有突变丰度低,检测区域内gc碱基含量高的特点,这些特点增加了tert启动子区域基因突变的检测难度。现有的检测方法有一代测序(一代测序即sanger测序)、等位基因特异性扩增(英文简称:arms-pcr)和高分辨率溶解曲线分析(英文简称:hrm)。其中hrm是根据dna序列的物理性质,应用高分辨率溶解曲线对样本进行分析,灵敏度可达到1%,但由于对核酸序列的gc碱基含量和tm值差异有较高要求,反应孔间0.1℃的差异就无法保证分析
3、因此,有必要开发一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法以解决现有技术存在的上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法,以解决sanger测序中对于gc碱基含量高、突变含量低的样本难以有效检测的问题。
2、第一方面,本专利技术提供了一种引物,所述引物用于检测tert基因启动子区c228t突变,所述引物包括第二上游引物和第三上游引物,所述第二上游引物用于扩增野生型和突变型dna模板,所述第三上游引物用于抑制野生型dna模板扩增。
3、可选的,所述第三上游引物由通用模板重叠序列、突变型模板匹配区序列、gc保守区域和阻遏序列依次连接组成。
4、可选的,所述引物还包括第一上游引物,所述第一上游引物的序列如seq id no.1所示,所述第二上游引物的序列如seq id no.2所示,所述第三上游引物的序列如seq idno.3所示。
5、可选的,所述引物还包括第一下游引物和第二下游引物,所述第一下游引物的序列如seq id no.4所示,所述第二下游引物的序列如seq id no.5所示。
6、可选的,所述第一上游引物与模板序列完全匹配,所述第二上游引物与模板序列完全匹配,所述第一下游引物与模板序列完全匹配,所述第二下游引物与模板序列完全匹配。
7、第二方面,本专利技术提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括所述引物,所述试剂盒用于检测tert基因启动子区c228t突变。
8、可选的,所述试剂盒还包括第一缓冲液和第二缓冲液,所述第一缓冲液包括序列如seq id no.1所示的第一上游引物和序列如seq id no.4所示的第一下游引物,所述第二缓冲液包括序列如seq id no.2所示的第二上游引物、序列如seq id no.3所示的第三上游引物和序列如seq id no.5所示的第二下游引物。
9、可选的,所述第一上游引物在所述第一缓冲液中的浓度为0.02μm~2μm,所述第一下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.02μm~2μm。
10、可选的,所述第二上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μm~2μm,所述第三上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.4μm~4μm,所述第二下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μm~2μm。
11、可选的,所述试剂盒还包括第一酶混合液、第二酶混合液、测序引物和阳性质控品。
12、可选的,所述阳性质控品包括tert基因启动子区c228t纯合突变的gdna标准品,所述gdna标准品在所述阳性质控品中的浓度为5ng/μl-20ng/μl。
13、第三方面,本专利技术提供了一种试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
14、s0:获取基因组dna,并将所述基因组dna作为模板,提供第一缓冲液、第一酶混合液、第二缓冲液、第二酶混合液和测序引物;
15、s1:将所述第一缓冲液、所述第一酶混合液和所述基因组dna混匀进行第一次pcr扩增以得到第一轮pcr产物;
16、s2:将所述第二缓冲液、所述第二酶混合液和所述第一轮pcr产物混匀进行第二次pcr扩增以得到第二轮pcr产物;
17、s3:对所述第二轮pcr产物进行sanger测序。
18、可选的,步骤s3中,对所述第二轮pcr产物进行sanger测序具体包括以下步骤:对所述第二轮pcr产物进行sanger测序以得到测序峰图,通过所述测序峰图识别tert基因启动子区c228t的突变情况,当所述测序峰图的计算检测位点的信号比≥10%时,阳性检测结果为有效。
19、本专利技术的有益效果在于:
20、1.第二上游引物和第三上游引物发生协同作用,第二上游引物用于扩增野生型和突变型dna模板,第三上游引物用于抑制野生型dna模板扩增,从而使得突变型dna模板在总扩增dna模板中的占比提高,具体为:第二上游引物和第三下游引物能够使得第二次pcr扩增过程中竞争性抑制野生型dna模板的扩增,从而显著提高突变型dna序列占总扩增dna模板的比例。使得sanger测序对突变位点的检测灵敏度从20%提高至1%,且保持较高的准确率和特异性。
21、2.第三上游引物中的gc保守区域的选择和设计可降低第二次pcr扩增过程中的tm值,从而在增加dna模板扩增效率的基础上,最大程度降低非特异性扩增的发生,保证检测结果的特异性。
22、3.引物均没有进行额外的化学修饰、生物素或荧光基团标记,使得引物的成本低廉,可以应用于临床大范围检测tert基因启动子区c228t突变。
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1.一种用于检测TERT基因启动子区C228T突变的引物,其特征在于,所述引物包括第二上游引物和第三上游引物,所述第二上游引物用于扩增野生型和突变型DNA模板,所述第三上游引物用于抑制野生型DNA模板扩增。
2.根据权利要求1所述的引物,其特征在于,所述第三上游引物由通用模板重叠序列、突变型模板匹配区序列、GC保守区域和阻遏序列依次连接组成。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,还包括第一上游引物,所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示,所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示,所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的引物,其特征在于,还包括第一下游引物和第二下游引物,所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示,所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求4所述的引物,其特征在于,所述第一上游引物与模板序列完全匹配,所述第二上游引物与模板序列完全匹配,所述第一下游引物与模板序列完全匹配,所述第二下游引物与模板序列完全匹配。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还包括第一缓冲液和第二缓冲液,所述第一缓冲液包括序列如SEQ ID NO.1所示的第一上游引物和序列如SEQ ID NO.4所示的第一下游引物,所述第二缓冲液包括序列如SEQ ID NO.2所示的第二上游引物、序列如SEQ IDNO.3所示的第三上游引物和序列如SEQ ID NO.5所示的第二下游引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述第一上游引物在所述第一缓冲液中的浓度为0.02μM~2μM,所述第一下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.02μM~2μM。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述第二上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μM~2μM,所述第三上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.4μM~4μM,所述第二下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μM~2μM。
10.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还包括第一酶混合液、第二酶混合液、测序引物和阳性质控品。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性质控品包括TERT基因启动子区C228T纯合突变的gDNA标准品,所述gDNA标准品在所述阳性质控品中的浓度为5ng/μL-20ng/μL。
12.一种如权利要求6~11中任一所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
13.根据权利要求12所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤S3中,对所述第二轮PCR产物进行Sanger测序具体包括以下步骤:对所述第二轮PCR产物进行Sanger测序以得到测序峰图,通过所述测序峰图识别TERT基因启动子区C228T的突变情况,当所述测序峰图的计算检测位点的信号比≥10%时,阳性检测结果为有效。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物,其特征在于,所述引物包括第二上游引物和第三上游引物,所述第二上游引物用于扩增野生型和突变型dna模板,所述第三上游引物用于抑制野生型dna模板扩增。
2.根据权利要求1所述的引物,其特征在于,所述第三上游引物由通用模板重叠序列、突变型模板匹配区序列、gc保守区域和阻遏序列依次连接组成。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,还包括第一上游引物,所述第一上游引物的序列如seq id no.1所示,所述第二上游引物的序列如seq id no.2所示,所述第三上游引物的序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求3所述的引物,其特征在于,还包括第一下游引物和第二下游引物,所述第一下游引物的序列如seq id no.4所示,所述第二下游引物的序列如seq id no.5所示。
5.根据权利要求4所述的引物,其特征在于,所述第一上游引物与模板序列完全匹配,所述第二上游引物与模板序列完全匹配,所述第一下游引物与模板序列完全匹配,所述第二下游引物与模板序列完全匹配。
6.一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-5中任一项所述的引物,所述试剂盒用于检测tert基因启动子区c228t突变。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还包括第一缓冲液和第二缓冲液,所述第一缓冲液包括序列如seq id no.1所示的第一上游引物和序列如seq id no.4所示的第一下游引物,所述第二缓冲液...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘磊,王彦博,段爱丽,吴晓刚,
申请(专利权)人:上海安甲生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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