【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子检测分析领域中，一种基于g4 dna酶响应的无标记crispr/cas12a化学发光试剂盒及其应用。
技术介绍
1、生物分子，尤其是疾病生物标志物的检测，在与疾病诊断、预后评估、疗效监测和疾病复发跟踪相关的临床应用中具有重要作用。然而，由于生物样本中存在的生物标志物丰度较低(尤其是在疾病早期)、体积小、易脆且易降解，因此对其进行检测和定量通常面临困难。这些挑战阻碍了直接、敏感和特异的生物分子检测应用的发展，而这些应用将彻底改变临床诊断。目前，聚合酶链式反应(pcr)被广泛认可为扩增稀有核酸靶标的黄金标准方法，而检测非核酸靶标(如蛋白质、金属离子和小分子)的有效选择包括酶联免疫吸附测定(elisa)、高效液相色谱(hplc)，以及质谱(ms)。然而，这些方法需要昂贵的试剂、专业设备和熟练的专业人员。同时，它们的操作时间长、技术要求高且难以在资源有限的环境下部署，从而限制了其在临床应用中的广泛使用。因此，需要迫切开发出方便、快速、高灵敏度的生物传感平台来解决这一问题。
2、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)相关蛋白(cas)系统，一般被称为crispr/cas系统。该系统最初在细菌和古菌中被发现，并成为基因编辑和基因调控相关应用的流行平台。最近的研究进展拓展了crispr/cas系统的多功能性，将其应用于高灵敏度和选择性的核酸检测工具。目前已知的crispr/cas系统包括crisp
3、基于化学发光(cl)的检测平台，如市售的辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(alp)催化系统，已经引起了广泛关注。这些催化系统具备优越的性能特征，包括低检测限、宽校准范围、快速响应、便于成像以及不依赖外部光源。因此，将天然酶或酶模拟物引入化学发光(cl)生物传感器中，已成功应用于蛋白质、核酸和小分子的检测。其中一种类型的酶模拟物包含富含g-四链体(g4)的序列，其形成了基于四链核酸的独特结构，具备高热力学和化学稳定性以及独特的配体结合和类过氧化物酶催化活性。当g4结构与特定配体(如血红素和钾离子(k+))结合时，会诱导g4 dna酶的形成。该酶可以催化鲁米诺-h2o2反应，产生化学发光信号。因此，通过这种方式，可将基于dna序列的信号转化为化学发光信号。预计该策略的应用将大大简化生物传感器的开发过程，并赋予其用户友好操作和可视化功能。
4、重要的是，基于化学发光的检测方法，如当前基于酶标记报告子的crispr/cas12a化学发光平台，具备固有的高敏感性和特异性。此外，它们易于执行，能够产生可见的信号，并且易于小型化，非常适合用作护理点测试(poct)生物传感器平台。然而，实施这些方法的成本可能相对较高，需要复杂的制备步骤和高水平的专业技术知识，并且无法在资源有限的环境中实现无标记、方便、便携和经济高效的现场检测。尽管存在这些挑战，但基于crispr/cas12a化学发光的简单灵敏系统作为生物传感器系统的一部分，在许多应用中受到越来越多的关注。
5、智能手机被视为一种不可或缺的工具，能够完成与现代生活方式相关的各种任务。近年来，随着手机技术的研究突破，嵌入式硬件和软件得以迅速发展，使智能手机具备了高端成像和数据分析处理能力。因此，越来越多的研究人员将智能手机用作具有巨大应用潜力的成像、显微、传感、诊断和测量工具。常见的智能手机嵌入式组件包括相机、usb接口、蓝牙等无线数据传输设备、光传感器、温度传感器、压力传感器、热图像传感器、陀螺仪、距离/重力/方向传感器等，以及用户友好的传感工具，可以与各种分析系统进行交互，使其适用于基于电化学和光学检测的应用。
技术实现思路
1、本专利技术利用化学发光反应的高特异性和高效性，以及crispr/cas12a的反式切割能力，开发了一种普适的、可用智能手机辅助的、无标记的基于crispr/cas12a dna酶的化学发光生物传感试剂盒。该试剂盒可以在现场进行核酸和非核酸靶点的超灵敏和视觉检测，有望拓宽基于crispr-cas系统技术的应用范围，并有可能彻底改变生物分子标记物的现场临床检测方式。
2、本专利技术的试剂盒是一种基于g-四链体-hemin dna酶的crispr/cas12a化学发光试剂盒，其包括以下组分：
3、(1)g4 dna酶系统，包括g-四链体-hemin dna酶和g-四链体-hemin dna酶的底物，所述底物为鲁米诺和h2o2；
4、(2)crispr/cas12a系统，包括cas12a蛋白质和crrna；所述crrna能够与核酸靶标或非核酸靶标的适配体特异性结合。
5、所述试剂盒可用于检测核酸靶标或非核酸靶标。
6、上述试剂盒中，所述g-四链体-hemin dna酶可为g-四链体与酶辅因子的复合物，其中，所述酶辅因子为血红素和钾离子。
7、其中，所述g-四链体的序列可如seq id no：4所示。
8、所述g-四链体-hemin dna酶可由g-四链体与所述酶辅因子在g4 dna酶缓冲液中形成；所述g4 dna酶缓冲液为ph 7.5-8.5的tris-hcl缓冲液。
9、具体的，tris-hcl缓冲液如下：200mm nacl、20mm kcl、0.05％(体积百分比)triton x-100和25mm tris，hcl调节ph至8.0，余量为水。
10、本专利技术的基于g4 dna酶响应的无标记crispr/cas12a化学发光试剂盒，利用了crispr/cas12a的反式切割能力以及g4-dna酶催化化学发光的机制，在血红素和钾离子(k+)存在下，g4-dna酶可以催化鲁米诺-h2o2反应产生基于化学发光的信号，外部加入的核酸能够通过设计好的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于G-四链体-hemin DNA酶的CRISPR/Cas12a化学发光试剂盒，包括以下组分：
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述G-四链体-hemin DNA酶为G-四链体与酶辅因子的复合物，其中，所述酶辅因子为血红素和钾离子。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中特征在于：所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述暗盒包括盒体、盒盖和抽屉，所述抽屉设置在盒体下部，用于放置检测体系，所述盒盖为活动设置，其尺寸与所述手持式检测设备相适配，以实现所述手持式检测设备对检测体系的拍摄。
5.根据权利要求1-4中任意所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸靶标为猴痘病毒DNA，所述crRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
6.根据权利要求1-4中任意所述的试剂盒，其特征在于：所述非核酸靶标为ATP，所述非核酸靶标的适配体的序列如SEQ ID NO：2所示；
7.权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒在制备基于化学发光的检测平台中的应用。
8.一
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对于含有核酸靶标的待测样本，所述方法还包括检测前对所述核酸靶标进行扩增的步骤。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述孵育的体系中，G-四链体-heminDNA酶的浓度为10-100nM，其中血红素的浓度为80-120nM，鲁米诺的浓度为100-300μM。
...【技术特征摘要】
1.一种基于g-四链体-hemin dna酶的crispr/cas12a化学发光试剂盒，包括以下组分：
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述g-四链体-hemin dna酶为g-四链体与酶辅因子的复合物，其中，所述酶辅因子为血红素和钾离子。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中特征在于：所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述暗盒包括盒体、盒盖和抽屉，所述抽屉设置在盒体下部，用于放置检测体系，所述盒盖为活动设置，其尺寸与所述手持式检测设备相适配，以实现所述手持式检测设备对检测体系的拍摄。
5.根据权利要求1-4中任意所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸靶标为猴痘病毒dna，所述crrna的序列如seq id no...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭英，蒋宇扬，陈辉，谭春燕，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：
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