【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及小鼠转录因子敲除筛选文库及其构建方法。
技术介绍
1、crispr/cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术后在生命科学领域应用最为广泛、高效率的基因编辑技术。ⅱ型crispr/cas系统在发挥基因编辑功能时只需要cas9一种核酸酶参与作用，避免了其它类型crispr需要多蛋白相互作用的过程。crispr/cas9基因编辑技术凭借其简单方便、操作性强等优势，2013年被science杂志列入十大科技研究进展之一。在后基因组学时代运用crispr基因敲除技术探究基因对信号通路转导，个体发育等生命活动中的具体功能，成为了强有力的工具。运用crispr/cas9技术在斑马鱼、小鼠、恒河猴、果蝇等动物的受精卵或胚胎进行基因敲除，构建基因敲除模型，在生长机制调控、肿瘤免疫治疗、药物靶点研究分析、耐药机制研究等研究中起到重要作用。
2、crispr/cas9系统主要两部分组成：一部分由crrna(crispr-derived rna)含有20nt序列能够特异性结合不同靶标基因。crrna与tracrr[1]na(trans-activating rna)形成tracrrna/crrna复合物作为cas9蛋白结合结构域，招募cas9蛋白到crrna结合的基因序列处对目的基因进行切割。损伤的dna序列能够通过非同源末端连接(non-homologous endjoining，nhej)和同源介导双链dna修复(homology directed repair，hdr)对断裂
3、高通量基因筛选技术的出现在全基因组范围或部分基因组范围内通过干扰基因表达筛选候选基因，成为功能性基因筛选的重要手段。crispr/cas9技术的发展使得在多基因范围甚至全基因组规模上构建基因敲除载体文库成为了可能。特别是基于crispr的敲除文库技术的出现及其与单细胞测序技术的结合，有助于对人类基因组中功能调节元件进行高通量筛选，为功能基因组学的研究提供新的研究方法，有利于阐明复杂疾病的发病机制，让精准找到治疗性的靶基因成为可能，使用crispr基因敲除文库构建细胞敲除文库在哺乳动物全基因组范围内进行基因敲除并筛选候选基因开创了基因组研究的新时代。
4、转录因子通过与特定dna结合序列结合来帮助打开或关闭基因，调控了几乎整个基因组。转录因子能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度、时间、空间去表达的蛋白质分子。人类基因组中20000多个基因在不同的组织、不同的时间具有表达差异性，因此转录因子的调控起到重要的作用，探究转录因子的对基因表达以及信号转导的生物学功能具有重要的研究意义。
5、高通量测序经过多年发展，深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，也在逐渐征服临床应用。进行高通量测序分析可以通过一系列分析找到靶标基因基因，然后进行下游靶基因的验证。然而，目前对于基因调控上游的研究机制相对较少，运用基因敲除筛选技术结合高通量测序技术能够筛选出基因潜在的转录调控基因。目前现有的crispr敲除筛选文库存在的缺陷：1、目前在科学研究中主要是针对全基因组范围内的crispr敲除文库或者其他通路相关的文库，并没有设计针对小鼠转录因子范围的敲除文库；2、大范围的全基因组敲除文库容易引入假阳性靶标基因的出现，容易对候选基因的筛选造成干扰；3、需要进行多次单细胞测序才能得到整个敲除测序结果；4、目前敲除筛选文库首先要构建携带cas9的稳转细胞系，随后再构建敲除文库细胞，这使得文库构建方法更为复杂。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的上述问题，本专利技术的目的在于提供一种小鼠转录因子基因敲除筛选文库及其构建方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种小鼠转录因子敲除筛选文库，其包括靶向鼠源转录调控相关转录因子基因的sgrna+cas9表达质粒，靶向鼠源转录调控相关转录因子基因包括basic domian group转录因子基因、beta-scaffold factors转录因子基因、helix-turn-helix转录因子基因、otheralpha-helix group转录因子基因、unclassified structure转录因子基因和zinc-coordinating转录因子基因；所述basic domian group转录因子基因的sgrna序列如seqid no.1～525所示，所述beta-scaffold factors转录因子基因的sgrna序列如seq idno.526～651所示，所述helix-turn-helix转录因子基因的sgrna序列如seq id no.652～1818所示，所述other alpha-helix group转录因子基因的sgrna序列如seq id no.1819～2004所示，所述unclassified structure转录因子基因的sgrna序列如seq id no.2005～2262所示，所述zinc-coordinating转录因子基因的sgrna序列如seq id no.2263～4185所示。
4、上述一种小鼠转录因子敲除筛选文库的构建方法，其包括以下步骤：
5、1)针对靶向鼠源转录调控相关转录因子基因的蛋白编码区设计sgrna序列及其互补序列；
6、2)将步骤1)设计的sgrna序列及其互补序列退火，形成双链dna片段；
7、3)使用bsmbi酶切lenti crisprv2质粒，得到酶切后的lenti crisprv2质粒；
8、4)将步骤2)的双链dna片段与步骤3)酶切后的lenti crisprv2质粒使用t4 dna连接酶进行连接；
9、5)将步骤4)的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩大培养后一代测序；
10、6)将测序结果正确的菌液进行扩增抽提，从而获得由靶向不同鼠源转录调控相关转录因子基因的sgrna+cas9表达质粒构成的小鼠转录因子敲除筛选文库。
11、进一步的，上述退火的程序为：37℃30min，95℃5min，-1℃/min逐步降温至25℃，25℃5min，4℃+∞。
12、进一步的，上述的构建方法还包括对小鼠转录因子敲除筛选文库质量的检测，所述检测包括检测小鼠转录因子敲除筛选文库的覆盖度和均一性，以及检测设计的sgrna是否可以正常引导spcas9蛋白靶向目的鼠源转录调控相关转录因子基因的特异性序列进行切割导致双链特异性断裂。
13、进一步的，上述检测小鼠转录因子敲除筛选文库的覆盖度和均一性具体为：将小鼠转录因子敲除筛选文库与慢病毒辅助质粒共同转染293t细胞，进行慢病毒包装，收集病毒液，测定滴度，按照moi＝0.3的感染复数感染l929小鼠成纤维细胞，感染72h后换液用8μg/ml的嘌呤霉素筛选，筛选6天后收取本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.小鼠转录因子敲除筛选文库，其特征在于：包括靶向鼠源转录调控相关转录因子基因的sgRNA+Cas9表达质粒，靶向鼠源转录调控相关转录因子基因包括Basic Domian group转录因子基因、Beta-Scaffold Factors转录因子基因、Helix-turn-helix转录因子基因、Other Alpha-Helix Group转录因子基因、Unclassified Structure转录因子基因和Zinc-Coordinating转录因子基因；所述Basic Domian group转录因子基因的sgRNA序列如SEQID NO.1~525所示，所述Beta-Scaffold Factors转录因子基因的sgRNA序列如SEQ IDNO.526~651所示，所述Helix-turn-helix转录因子基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.652~1818所示，所述Other Alpha-Helix Group转录因子基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.1819~2004所示，所述Unclassified Structure转录因子基因的sgRNA序列如S
2.如权利要求1所述的小鼠转录因子敲除筛选文库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述退火的程序为：37℃ 30min，95℃5min，-1℃/min逐步降温至25℃，25℃ 5min，4℃ +∞。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：还包括对小鼠转录因子敲除筛选文库质量的检测，所述检测包括检测小鼠转录因子敲除筛选文库的覆盖度和均一性，以及检测设计的sgRNA是否可以正常引导SpCas9蛋白靶向目的鼠源转录调控相关转录因子基因的特异性序列进行切割导致双链特异性断裂。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述检测小鼠转录因子敲除筛选文库的覆盖度和均一性具体为：将小鼠转录因子敲除筛选文库与慢病毒辅助质粒共同转染293T细胞，进行慢病毒包装，收集病毒液，测定滴度，按照MOI=0.3的感染复数感染L929小鼠成纤维细胞，感染72h后换液用8μg/ml的嘌呤霉素筛选，筛选6天后收取细胞并提基因组，以NGS258引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行扩增子高通量测序，将测序结果与文库中sgRNA序列进行比对，从而确定小鼠转录因子敲除筛选文库的覆盖度与均一性；所述NGS 258引物对序列为：
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述检测设计的sgRNA是否可以正常引导SpCas9蛋白靶向目的鼠源转录调控相关转录因子基因的特异性序列进行切割导致双链特异性断裂具体为：sgRNA靶标基因序列位置一代测序出现套峰，则判定为进行双链切割。
...【技术特征摘要】
1.小鼠转录因子敲除筛选文库，其特征在于：包括靶向鼠源转录调控相关转录因子基因的sgrna+cas9表达质粒，靶向鼠源转录调控相关转录因子基因包括basic domian group转录因子基因、beta-scaffold factors转录因子基因、helix-turn-helix转录因子基因、other alpha-helix group转录因子基因、unclassified structure转录因子基因和zinc-coordinating转录因子基因；所述basic domian group转录因子基因的sgrna序列如seqid no.1~525所示，所述beta-scaffold factors转录因子基因的sgrna序列如seq idno.526~651所示，所述helix-turn-helix转录因子基因的sgrna序列如seq id no.652~1818所示，所述other alpha-helix group转录因子基因的sgrna序列如seq id no.1819~2004所示，所述unclassified structure转录因子基因的sgrna序列如seq id no.2005~2262所示，所述zinc-coordinating转录因子基因的sgrna序列如seq id no.2263~4185所示。
2.如权利要求1所述的小鼠转录因子敲除筛选文库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：王心睿，叶洲杰，朱丽萍，陈雨佳，
申请(专利权)人：福建省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：
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