【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，尤其涉及一种华丽龙胆vigs体系的构建方法及其应用。
技术介绍
1、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,vigs)是一种转录后基因沉默现象，可引起内源mrna序列特异性降解，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反应该基因功能。该技术利用携带植物功能基因的cdna病毒，诱导植物产生基因沉默，进而导致表型变化。相对于转基因等方法，vigs技术具有简单、高效、周期短、能沉默基因家族、无需转基因植株以及通量高等特点。这种方法可以对不同遗传背景的植物进行基因功能比较，为功能基因组和特定基因功能的研究提供了一种有效的手段。此外，该技术甚至可以用于研究一些突变后可能致死的基因功能。因此，vigs技术在植物生长发育、抗病虫和代谢调控等方面的功能基因研究中得到了广泛应用。
2、华丽龙胆是龙胆科龙胆属多年生草本植物，具有较高的药用价值和观赏价值，主要分布在中国西南部，其根、花可作为药材，具有泻肺清热的功效，可治疗邪热壅肺之咳嗽、气喘、咳痰不爽等多种病症；其次，作为一种珍贵的野生花卉，它的花冠呈现明亮的蓝色，是解析蓝色花呈色机理的理想材料。
3、目前华丽龙胆的研究主要集中在化学成分分析、药用价值挖掘等方面，而对华丽龙胆呈色机理的研究甚少，因此研究一种根据表型变异来进行基因功能分析，实现植物基因功能的快速鉴定至关重要，可以为花色改良、蓝色花新品种的培育提供参考。建立华丽龙胆的vigs体系，可快速有效地对其关键基因进行功能验证，对于解析其重要
4、鉴于以上情况，亟须针对华丽龙胆vigs体系的构建方法及其应用进行研究。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种华丽龙胆vigs体系的构建方法及其应用，能快捷、方便的验证华丽龙胆花冠呈蓝色的关键芳香酰基修饰基因gs5at的基因功能。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种沉默华丽龙胆f3′5′h基因的特异性核苷酸片段，序列如seq id no.1所示。
4、一种华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法，包括以下步骤：
5、(1)将沉默华丽龙胆f3′5′h基因的特异性核苷酸片段连接至trv2载体的多克隆位点上，获得trv2-gsf3′5′h重组质粒；将trv2-gsf3′5′h重组质粒转化农杆菌，获得trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌，培养收集菌体备用；
6、(2)用缓冲液分别将trv1农杆菌、trv2农杆菌、trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌的菌体重悬分散制成农杆菌菌液；然后将trv1农杆菌菌液分别与trv2农杆菌菌液和trv2-gsf3′5′h农杆菌菌液混合为侵染液；
7、(3)取华丽龙胆盛花期植株，将植株根部洗净，完全浸泡于侵染液中,进行真空渗透处理；
8、(4)用无菌水清洗植株根部上多余的侵染液2-3次，然后将华丽龙胆植株放入培养箱培养，观察其表型变化，即构建得到华丽龙胆的目的基因vigs体系。
9、通过农杆菌介导法侵染华丽龙胆植株，使华丽龙胆f3′5′h基因发生沉默，有效降低了f3′5′h表达水平，导致华丽龙胆花瓣蓝色变浅，表明基于trv的trv2-gsf3′5′h沉默载体成功构建了华丽龙胆vigs体系，该体系的构建是研究华丽龙胆呈色基因功能的关键。本研究通过f3′5′h保守域构建trv2-f3′5′h载体，利用农杆菌介导法侵染华丽龙胆盛花期植株，比较分析不同农杆菌侵染浓度、真空渗透法不同压力对trv诱导的f3′5′h基因沉默的影响，为华丽龙胆花冠呈色关键基因的功能研究奠定基础。
10、华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法还包括对照，对照是用trv2农杆菌替换trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌，其余步骤均以上述的构建方法相同。以trv2-空载侵染液进行真空渗透处理的华丽龙胆植株为对照，观察trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌侵染液真空渗透处理的华丽龙胆植株花冠表型，检测目的基因表达情况。
11、通过筛选侵染范围比较广泛的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)作为vigs体系的载体。trv是广泛应用于各种植物物种中最常见的病毒载体，它具有侵染后症状较轻、基因沉默效率高、可在多个组织产生沉默且效果长久等优点。
12、步骤(2)中的缓冲液含有10mm mes、200μm乙酰丁香酮和10mmmgcl，余量为双蒸水，ph5.6。
13、优选地，步骤(2)中所述trv1农杆菌菌液、trv2农杆菌菌液、trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌菌液的od600＝1，trv1农杆菌菌液分别与trv2农杆菌菌液和trv2-gsf3′5′h农杆菌菌液按体积比1:1混合为侵染液。
14、优选地，步骤(3)中所述华丽龙胆盛花期植株为花冠完全开放的丽龙胆植株。
15、优选地，步骤(3)中所述真空渗透处理为：在真空度达到0.7atm后，保持3min，随后缓慢放气恢复正常气压。
16、优选地，步骤(4)中所述培养条件为：将华丽龙胆植株置于10℃下黑暗培养24h后，放入人工气候箱昼夜交替培养，温度控制在15℃。
17、所述的华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法在华丽龙胆花色基因功能研究中的应用。能快捷、方便的验证华丽龙胆花冠呈蓝色的关键芳香酰基修饰基因gs5at的基因功能。
18、本专利技术的有益效果在于：
19、本专利技术基于烟草脆裂病毒(trv)的重组沉默载体，利用真空渗透处理方法成功创建了适合华丽龙胆的vigs体系，以f3′5′h构建的沉默载体，成功实现了华丽龙胆f3′5′h基因的沉默；与此同时还确定了华丽龙胆侵染的最佳菌液浓度和最佳侵染压强，并将该体系应用于华丽龙胆芳香酰基修饰基因gs5at的功能研究，被侵染的沉默处理组样品的表型发生明显变化，并且通过对该处理组样品的基因表达量测定，发现其花冠gs5at基因表达量显著降低，表明本专利技术的华丽龙胆vigs体系可以成功应用于华丽龙胆基因功能验证，本专利技术构建的vigs体系对于华丽龙胆基因功能研究具有重要意义。
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1.一种沉默华丽龙胆F3′5′H基因的特异性核苷酸片段，其特征在于，序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述TRV1农杆菌菌液、TRV2农杆菌菌液、TRV2-GsF3′5′H目的基因特异性片段农杆菌菌液的OD600＝1，TRV1农杆菌菌液分别与TRV2农杆菌菌液和TRV2-GsF3′5′H农杆菌菌液按体积比1:1混合为侵染液。
4.如权利要求2所述的华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述华丽龙胆盛花期植株为花冠完全开放的丽龙胆植株。
5.如权利要求2所述的华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述真空渗透处理为：在真空度达到0.7atm后，保持3min，随后缓慢放气恢复正常气压。
6.如权利要求2所述的华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法，其特征在于，步骤(
7.一种权利要求2-6任一项所述的华丽龙胆F3′5′H基因的VIGS体系的构建方法在华丽龙胆花色基因功能中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种沉默华丽龙胆f3′5′h基因的特异性核苷酸片段，其特征在于，序列如seq idno.1所示。
2.一种华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述trv1农杆菌菌液、trv2农杆菌菌液、trv2-gsf3′5′h目的基因特异性片段农杆菌菌液的od600＝1，trv1农杆菌菌液分别与trv2农杆菌菌液和trv2-gsf3′5′h农杆菌菌液按体积比1:1混合为侵染液。
4.如权利要求2所述的华丽龙胆f3′5′h基因的vigs体系的构建方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：金雪花，黄莎莎，孟晗，李嘉伟，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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