【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方法。
技术介绍
1、目前，全基因组关联分析(genome wide association studies,gwass)已经鉴定出成千上万的复杂疾病相关致病/易感位点，典型的如单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,snp)，并且大部分位于基因组非编码区。因此，深入解析这些非编码区疾病易感snps的分子遗传调控机制是后gwas时代的重点及难点。近年来，随着二代测序技术(next generation sequencing,ngs)的发展，研究者相继开发了多种基于二代测序的高通量调控元件检测技术，用以鉴定非编码区功能元件及易感snp的调控活性，典型代表为大规模平行报告系统(massively parallel reporter assay,mpra)和自转录激活调控区域测序(self-transcribing active regulatory region sequencing,starr-seq)。得益于这些新技术，研究者能够系统性检测成千上万个功能元件及疾病易感snps的碱基特异性(allele specific expression)调控活性。
2、高通量报告分析系统(mpra及starr-seq)主要包含3个步骤：1)候选片段质粒文库构建；2)质粒文库转染靶细胞表达；3)高通量测序文库构建(质粒测序文库及rna表达测序文库)。针对步骤1，目前多采用全基因组片段超声打断或芯片捕获技术获得候选片段，但
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方法，该方法是一种高效低廉的基于高通量测序的建库方法，用以鉴定基因组上具有碱基特异性调控活性的功能元件。
2、为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术提供一种基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方法，包括：
4、构建候选易感snp质粒文库；
5、对所述候选易感snp质粒文库进行pcr扩增、纯化后构建输入型dna测序文库；
6、转染质粒文库至靶细胞，获得rna表达文库；进行反转录、纯化、pcr扩增，构建输出型dna测序文库；
7、对输入型dna测序文库和输出型dna测序文库分别添加一步法pcr扩增为不同重复组引入不同的barcode标签序列，并分别进行末端加a尾及测序接头连接，构建混合样本测序库。
8、作为本专利技术进一步改进，所述构建候选易感snp质粒文库，包括：
9、由包含所有候选snp不同等位基因型的单链dna文库得到双链dna文库，组装双链dna文库与酶切后的报告载体，构建候选易感snp质粒文库。
10、作为本专利技术进一步改进，所述由包含所有候选snp不同等位基因型的单链dna文库得到双链dna文库，组装双链dna文库与酶切后的报告载体，构建候选易感snp质粒文库；具体包括：
11、a.利用精准引物池合成方法，获得包含所有候选snp不同等位基因型的单链dna文库；
12、b.利用第一引物与第二引物pcr扩增单链dna文库并纯化，获得双链dna文库；
13、c.使用age i及sal i双酶切高通量报告载体，组装双链dna文库与酶切后的报告载体，构建成包含所有候选snp不同基因型的候选易感snp质粒文库；
14、其中，第一引物及第二引物的具有pcr接头序列-f与r的碱基互补区。
15、作为本专利技术进一步改进，所述利用精准引物池合成方法之前还包括：
16、以候选snp为中心，获得snp上下游的序列信息，在序列两端分别添加pcr接头序列f及r，得到建库的序列全集合。
17、作为本专利技术进一步改进，所述对所述候选易感snp质粒文库进行pcr扩增、纯化后构建输入型dna测序文库，包括：
18、a.使用第三引物对候选易感snp质粒文库进行一步法pcr扩增，纯化后获得带有特异性分子标签的dna文库；
19、b.使用第四引物及第五引物pcr扩增带有特异性分子标签的dna文库，纯化后得到输入型dna测序文库。
20、作为本专利技术进一步改进，所述第三引物为特异性分子标签引物，由如下3部分组成：
21、随机序列是由多个碱基组成，为特异性分子标签区，在反转录及一步法pcr过程中，为每条rna/质粒提供特异性分子标签；
22、随机序列3'端为第二引物，特异性识别候选易感snp质粒文库表达出的rna；
23、随机序列5'端为第五引物，为下一步pcr扩增提供结合区。
24、作为本专利技术进一步改进，所述使用第三引物对候选易感snp质粒文库进行一步法pcr扩增，纯化后获得带有特异性分子标签的dna文库，具体包括：
25、瞬时转染候选易感snp质粒文库至靶细胞，充分表达后，提取细胞总rna，加入dnase i去除rna中的dna污染，使用poly(a)mrna磁珠分离模块处理总rna，并进一步浓缩纯化，获得rna表达文库；
26、使用第三引物对rna表达文库进行反转录，纯化后获得带有特异性分子标签的dna文库。
27、作为本专利技术进一步改进，所述转染质粒文库至靶细胞，获得rna表达文库；进行反转录、纯化、pcr扩增，构建输出型dna测序文库；包括：
28、a.转染质粒文库至靶细胞，提取细胞总rna，去除rna中的dna污染，分离、纯化，获得poly(a)mrna，获得rna表达文库；
29、b.使用第三引物对rna表达文库进行反转录，纯化后获得带有特异性分子标签的dna文库；
30、c.使用第六引物与第五引物pcr扩增带有特异性分子标签的dna文库，获得输出型dna测序文本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述构建候选易感SNP质粒文库，包括：
3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述由包含所有候选SNP不同等位基因型的单链DNA文库得到双链DNA文库，组装双链DNA文库与酶切后的报告载体，构建候选易感SNP质粒文库；具体包括：
4.根据权利要求3所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述利用精准引物池合成方法之前还包括：
5.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述对所述候选易感SNP质粒文库进行PCR扩增、纯化后构建输入型DNA测序文库，包括：
6.根据权利要求5所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述第三引物为特异性分子标签引物，由如下3部分组成：
7.根据权利要求5所述的基于高
8.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述转染质粒文库至靶细胞，获得RNA表达文库；进行反转录、纯化、PCR扩增，构建输出型DNA测序文库；包括：
9.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述对输入型DNA测序文库和输出型DNA测序文库分别添加一步法PCR扩增为不同重复组引入不同的Barcode标签序列，包括：
10.根据权利要求9所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述分别进行末端加A尾及测序接头连接，构建混合样本测序库，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述构建候选易感snp质粒文库，包括：
3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述由包含所有候选snp不同等位基因型的单链dna文库得到双链dna文库，组装双链dna文库与酶切后的报告载体，构建候选易感snp质粒文库；具体包括：
4.根据权利要求3所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述利用精准引物池合成方法之前还包括：
5.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，其特征在于，所述对所述候选易感snp质粒文库进行pcr扩增、纯化后构建输入型dna测序文库，包括：
6.根据权利要求5所述的基于高通量测序的鉴定碱基特异性调控元件的建库方方法，...
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