【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程，具体是涉及菠萝转录因子acwrky31基因在植物耐干旱上的应用。
技术介绍
1、菠萝(ananas comosus)作为一种重要的热带经济水果作物，由于其独特的风味，广受消费者的喜爱。但近年来，由于种植环境的变化和不科学的农业耕作，导致菠萝在生长发育过程中受到各种生物胁迫和非生物胁迫的危害，严重影响菠萝的品质和产量。
2、不断变化的环境对于植物的生长和发育具有一定的胁迫性，干旱、低温和高盐等非生物胁迫因素对植株生长发育的负面影响变得十分突出，随着全球气候的不断变化，各个地区的降雨量分布极不平衡，干旱的地区更加干旱。有报道称，全球普遍发生的干旱事件，将导致小麦减产21％，玉米减产40％。在干旱条件下，植物的生长变得缓慢，尤其明显的是当叶片形态发生变化时，如叶片面积和数量显著减少，此外有报道称，植物根系生物量也会随着干旱胁迫的加剧而增加。
3、干旱胁迫通常发生在土壤中有效水分的减少以及大气条件通过蒸腾或蒸发导致水分持续流失的情况下。它会导致植物气体交换受到限制，严重破坏植物的代谢和细胞结构，最终导致酶催化反应的终止。同时，植物体内含水量会减少，叶片水势下降，从而细胞增大且增殖能力减弱，引起气孔关闭，导致植物不能顺利进行光合作用，代谢受到阻碍，严重的情况会造成植物死亡。
4、wrky转录因子在植物的抗病抗逆方面发挥着重要的作用。在干旱胁迫下，耐旱植物通过蔗糖代谢积累寡糖，提高抗旱性。此外，wrky转录因子还通过脱落酸(aba)和ros相关信号通路调控植物的耐受性，干旱胁迫
5、目前关于研究菠萝wrky基因功能的报道少之又少。所以通过研究wrky转录因子在菠萝抗逆抗病过程中的功能，为今后解决菠萝生物和非生物胁迫问题以及选育菠萝的优良品种，提高特种经济作物产量和促进农业的快速发展，提供理论基础和数据支撑。
技术实现思路
1、本专利技术对菠萝转录因子acwrky31基因进行过表达载体的构建，并利用农杆菌遗传转化技术，侵染菠萝的愈伤组织，从而获得菠萝转基因植株，以此来鉴定转基因植株抗旱抗逆的能力，因此在生产中具有重要的意义。
2、为了实现上述本专利技术的目的，采取如下技术方案：
3、菠萝转录因子acwrky31基因在调控植物干旱中的应用，它在调控菠萝抗干旱性方面的应用。
4、菠萝转录因子acwrky31基因的克隆方法，具体操作如下：
5、(1)md2叶片为材料，利用omega公司生产的rna提取试剂盒提取菠萝叶片的总rna；
6、(2)将提取到到菠萝叶片总rna反转录pcr获得cdna，以cdna为模板扩增目的序列；
7、pcr扩增引物为：
8、acwrky31-f:atgaagaacgaatcggtctgc，
9、acwrky31-r:ggaagaatcaaaagaagggaa。
10、作为技术方案的优选，步骤(1)中总rna的提取具体步骤：
11、(1-1)取新鲜的md2叶片组织材料于ep管中，冷冻保存；
12、(1-2)将菠萝叶片组织放入研钵里，用研磨棒将叶片组织充分磨碎；将研磨成细粉末的叶片组织装入离心管中；
13、(1-3)样品充分碾磨后，加入1ml的rna solv reagent溶液，震荡均匀，室温孵育匀浆5min；
14、(1-4)加入300μl氯仿，漩涡20-30s，室温孵育2～3min，温度控制4℃，采用12000rpm离心10-15min；
15、(1-5)转移上清液于新的ep管中，加入等体积异丙醇混匀；
16、(1-6)转移上清液于收集柱中，室温下10000rpm离心1-2min，弃滤液；
17、(1-7)加入500μl rna洗脱液i于收集柱中，室温下10000rpm离心1min，弃滤液和收集管；
18、(1-8)换一个新的收集管，加入600μl的rna洗脱液ⅱ于收集柱中，室温下10000rpm离心1-2min，弃滤液；
19、(1-9)重复步骤(1-8)，室温下10000rpm离心2-3min，弃收集管；
20、(1-10)室温最大转速10000rpm，空离心2-3min；
21、(1-11)将收集柱转移到新的离心管中，加入50μl的rnase-free ddh2o，室温静置2-3min，室温下10000rpm离心2-3min，放置于冰上；
22、(1-12)测rna浓度，做好标记，放置于-80℃超低温环境保存备用；
23、(1-13)cdna的合成：根据rna浓度，计算所用的体积，pcr仪进行反转，反应体系为：rna 1μg；5×all-in-one qrt supermix 4μl；enzyme mix 1μl；rnase-free ddh2o补至总体积为20μl，具体pcr反应程序：50℃15min，85℃5s，4℃10min；反应结束后用depc水稀释，放置于-20℃环境保存备用；
24、(1-14)获得菠萝转录因子acwrky31基因的cds序列，按照primerstar聚合酶扩增体系和反应程序进行pcr反应：扩增程序为98℃预变性3min；34个循环的98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s/kb；72℃后延伸5min，12℃保存10min。
25、一种利用了菠萝转录因子acwrky31基因为目的基因的表达载体。具体操作为：将菠萝转录因子acwrky31基因连接到pentr载体上并进行转化，连接成功并测序无误后，将已连接上gateway入门载体pentr的目的载体与中间载体pgwb605进行lr重组反应，构建菠萝转录因子acwrky31基因的表达载体。
26、一种包含菠萝转录因子acwrky31基因表达载体的重组菌，其通过菠萝转录因子acwrky31基因表达载体导入农杆菌获得。
27、一种包含重组菌的转基因植株，是将菠萝转录因子acwrky31基因表达载体的重组菌导入菠萝中而得到菠萝转基因植株。
28、本专利技术的有益效果：
29、(1)本申请的转录因子acwrky31调控菠萝抗干旱性分析，为改良培育出抗干旱的菠萝品质适应不同生长环境的要求。
30、(2)本申请在菠萝植株抗干旱实验过程中，在未进行干旱胁迫处理时，acwrky31-oe转基因菠萝和野生型植株的生长情况没有差异。在进行干旱胁迫处理3周后，acwrky31-oe转基因各株系菠萝的叶片基本呈现干枯下垂的状态，而野生型植株的大部分叶子是处于挺拔直立的状态，结果表明过表达acwrky31过表达增强了转基因菠萝对干旱胁迫的敏感性。说明菠萝转录因子ac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.菠萝转录因子AcWRKY31基因在调控植物干旱中的应用，其特征在于，它在调控菠萝抗干旱性方面的应用。
2.菠萝转录因子AcWRKY31基因的克隆方法，其特征在于，利用基因工程方法，具体操作如下：
3.根据权利要求2所述的菠萝转录因子AcWRKY31基因的克隆方法，其特征在于，
4.一种菠萝转录因子AcWRKY31基因表达载体，其特征在于，利用了权利要求2所述的菠萝转录因子AcWRKY31基因为目的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的菠萝转录因子AcWRKY31基因表达载体，其特征在于：利用了权利要求2所述的菠萝转录因子AcWRKY31基因连接到pENTR载体上并进行转化，连接成功并测序无误后，将已连接上GATEWAY入门载体pENTR的目的载体与中间载体pGWB605进行LR重组反应，构建菠萝转录因子AcWRKY31基因的表达载体。
6.一种包含权利要求5所述菠萝转录因子AcWRKY31基因表达载体的重组菌，其特征在于：所述重组菌通过菠萝转录因子AcWRKY31基因表达载体导入农杆菌获得。
7.一种
...【技术特征摘要】
1.菠萝转录因子acwrky31基因在调控植物干旱中的应用，其特征在于，它在调控菠萝抗干旱性方面的应用。
2.菠萝转录因子acwrky31基因的克隆方法，其特征在于，利用基因工程方法，具体操作如下：
3.根据权利要求2所述的菠萝转录因子acwrky31基因的克隆方法，其特征在于，
4.一种菠萝转录因子acwrky31基因表达载体，其特征在于，利用了权利要求2所述的菠萝转录因子acwrky31基因为目的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的菠萝转录因子acwrky31基因表达载体，其特征在于：利用...
【专利技术属性】
技术研发人员：王路路，秦源，柴改凤，罗甜甜，王小媚，程焱，郑平，黄东平，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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