【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫组织化学检测领域，具体涉及一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合及模型构建方法和应用。
技术介绍
1、免疫检查点抑制剂（icis）作为免疫治疗的主要组成部分，已经成为多种肿瘤治疗的基础。抗pd-1单抗通过阻断pd-l1和pd-1的相互作用来重新激活对肿瘤细胞的免疫反应，多项研究证明其相较传统化疗可以给患者带来更高的临床获益。尽管如此，抗pd-1单抗的客观反应率(orr)仅约为24%（95% ci，21%-28%）。因此，亟需开发针对抗pd-1单抗具有稳健预测能力的方法和产品，从而更好地指导患者分层和临床决策。
2、针对抗pd-1单抗治疗疗效预测的方法主要包括评估pd-l1蛋白表达、肿瘤突变负荷(tmb)和基因表达谱(gep)：
3、pd-l1免疫组织化学（ihc）检测pd-l1蛋白的表达是目前应用最广、证据最多的免疫治疗疗效预测方法，可作为非小细胞肺癌（nsclc）、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌患者的伴随或补充诊断。尽管pd-l1表达已被证明与某些肿瘤类型的治疗反应相关，但作为一种诊断检测方法，pd-l1 ihc现阶段存在许多局限性：（1）每张切片只能检测单一靶标，能提供的信息非常有限。（2）pd-l1在肿瘤内表达的异质性使得局部视野分析具有局限。（3）不同pd-l1检测产品存在抗体、检测环境、判读方法以及pd-l1阳性阈值的差异，现阶段面临检测和判读标准化的问题。（4）不同病理学家之间检测结果的重现性存在问题。（5）更为重要的是：pd-l1的表达只是影响肿瘤进展的肿瘤免疫微环境（time）因素
4、在临床实践中，一方面并不是所有的pd-l1高表达患者均能从免疫治疗中获益，另一方面部分pd-l1低表达的患者仍然能从免疫治疗中获益，pd-l1 ihc检测对免疫治疗疗效预测较为有限。因而除pd-l1 ihc检测以外，其他预测免疫检查点治疗疗效的标志物也在不断出现。tmb就是其中之一，并已从临床研究逐步走向临床应用。但tmb作为预测标志物同样存在诸多不足之处：（1）tmb的数量并不能准确预测免疫疗效，因为它和能够激发免疫反应的基因突变数量并不成严格的比例；（2）不同类型肿瘤tmb水平差异较大；（3）年龄对tmb表达水平影响较大，并且两者之间的关系因疾病类型的不同而有所差异；（4）tmb的检测由于依赖基因测序，成本远高于依靠免疫组化的pd-l1检测；（5）不同平台的检测标准不统一；
5、此外，不少研究也提示gep对免疫治疗也有一定的疗效预测价值。但基于普通转录组测序（bulk rna-seq）的gep同样存在不足之处：（1）肿瘤内rna的表达存在异质性，bulkrna-seq由于缺失了组织原位的信息，因而无法体现该异质性；（2）rna层面的异常并不一定能导致蛋白质功能的异常，因此可能仍需蛋白质层面的检测；（3）rna测序分析在临床实践中并没有被广泛接受的参考标准。
6、除了上述生物标志物外，越来越多的数据表明time中免疫细胞及其表面其它生物标志物在指导肿瘤患者药物选择和预后评估方面也具有重要意义。譬如，pd-1发现者陈列平教授等研究者基于time中pd-l1的表达和肿瘤浸润淋巴细胞(tils)的浸润情况将time分成了四种不同的类型：i型：pd-l1-/tils-；ii型：pd-l1+/tils+；iii型：pd-l1-/tils+；iv型：pd-l1+/tils-。这四种不同time类型与免疫治疗疗效密切相关。同样有研究显示巨噬细胞表面蛋白cd68与pd-l1的共定位不仅与nsclc免疫治疗疗效密切相关，还与三阴性乳腺癌预后相关。此外，数项免疫治疗队列分析显示，b细胞相关生物标志物与黑色素瘤免疫治疗疗效以及nsclc免疫治疗疗效相关。
7、上述研究报道印证了time中不同免疫细胞亚群与免疫治疗效果均密切相关，亟须一种可以检测和评估time中复杂免疫细胞亚群及其相互关系的方法，从而更精准地指导免疫治疗的患者分层。
8、多重免疫组化/免疫荧光（mihc/if）正是这样一种新技术。数项研究表明mihc/if在抗pd-1/pd-l1免疫治疗疗效判断中较其他方法优越。有现有技术系统分析了56篇文献中不同检测方法 (pd-l1 ihc、tmb、gep、mihc/if) 与抗pd-1/pd-l1免疫治疗反应的相关性。研究发现，相较于pd-l1 ihc、tmb及gep评估方法，mihc/if方法对于肿瘤免疫治疗具有更高的疗效预测价值。其中pd-l1 ihc、tmb、gep三种评估方法对肿瘤免疫治疗疗效预测评估指标auc值分别为0.650、0.688、0.650，而荟萃分析获得的mihc/if的auc值高达0.790，显著高于其余三种方法。此外，pd-l1 ihc、tmb、gep三种评估方法的两两组合的疗效预测评估指标auc为0.736，同样低于mihc/if的单一指标结果（lu, s., et al., comparison ofbiomarker modalities for predicting response to pd-1/pd-l1 checkpointblockade: a systematic review and meta-analysis. jama oncol, 2019. 5(8): p.1195-1204）。
9、以抗pd-1/pd-l1免疫治疗为核心的单药治疗以及联合化疗已经成为nsclc的标准治疗方案，并且逐渐进入到了早期肺癌的围手术期新辅助以及辅助治疗方案中。大量的基于mihc/if研究显示，time中多个免疫细胞亚群对nsclc免疫治疗具有显著的疗效预测价值：cd8+t细胞和空间免疫异质性（lopez de rodas, m., et al., role of tumorinfiltrating lymphocytes and spatial immune heterogeneity in sensitivity topd-1 axis blockers in non-small cell lung cancer. j immunother cancer, 2022.10(6)）、pd-l1和cd68的共定位（liu, y., et al., immune cell pd-l1 colocalizeswith macrophages and is associated with outcome in pd-1 pathway blockadetherapy. clin cancer res, 2020. 26(4): p. 970-977）以及pd-1和cd8的共定位（mazzaschi, g., et al., low pd-1 expression in cytotoxic cd8(+) tumor-infiltrating lymphoc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合，其特征在于，由以下标志物组成：Granzyme B、CD68、CD8、PD-L1、PANCK、Foxp3和CD45RO。
2.权利要求1所述的标志物组合在构建免疫治疗疗效预测模型中的应用。
3.一种免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，通过权利要求1所述的标志物组合进行构建。
4.根据权利要求3所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，采用整体PD-L1+PANCK+细胞阳性率、整体CD45RO+细胞阳性率、间质区CD8+细胞阳性率、间质区Granzyme B+细胞阳性率、肿瘤区CD68+PD-L1+细胞阳性率和100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离进行构建。
5.根据权利要求4所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，用于计算免疫评分，免疫评分计算方式为：（0.20-0.45）×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+（0.40-0.80）×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+（0.10-0.20）×（间质区CD8+细胞阳性率）+（0.05-0.15）×（整体CD
6.根据权利要求5所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，预测临界值为0.5。
7.根据权利要求6所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，所述的免疫评分计算方式为：0.42×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.63×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.20×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
8.根据权利要求3-7任一项所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，为预测抗PD-1抗体药物治疗疗效的模型。
9.根据权利要求8所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，为预测抗PD-1抗体药物治疗非小细胞肺癌疗效的模型。
10.权利要求3-9任一项所述的免疫治疗疗效预测模型的构建方法，其特征在于，包括：
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤（1）包括：烤片；脱蜡；水合；抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；荧光染色放大信号；每轮抗体染色后，重复抗原修复，进行下一轮抗体染色；封片；读片。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）包括：扫描后清楚完整的图像进行分析区域划分，划分规则为：
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤（3）中包括：
14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述的A中，通过DAPI着色和PANCK着色进行拆分；
...【技术特征摘要】
1.一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合，其特征在于，由以下标志物组成：granzyme b、cd68、cd8、pd-l1、panck、foxp3和cd45ro。
2.权利要求1所述的标志物组合在构建免疫治疗疗效预测模型中的应用。
3.一种免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，通过权利要求1所述的标志物组合进行构建。
4.根据权利要求3所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，采用整体pd-l1+panck+细胞阳性率、整体cd45ro+细胞阳性率、间质区cd8+细胞阳性率、间质区granzyme b+细胞阳性率、肿瘤区cd68+pd-l1+细胞阳性率和100微米内foxp3+细胞到panck+细胞的最短距离进行构建。
5.根据权利要求4所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，用于计算免疫评分，免疫评分计算方式为：（0.20-0.45）×（间质区granzyme b+细胞的阳性率）+（0.40-0.80）×（肿瘤区cd68+pd-l1+细胞的阳性率）+（0.10-0.20）×（间质区cd8+细胞阳性率）+（0.05-0.15）×（整体cd45ro+细胞的阳性率）+（0.05-0.15）×（整体区panck+pd-l1+细胞阳性率）+（0.70-0.90）×（100微米内foxp3+细胞到panck+细胞的最短距离）。
6.根据权利要求5所述的免疫治疗疗效预测模型，其特征在于，预测临界值为0.5。
7.根据权利要求6...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑健健，陈司东，王阳，焦磊，
申请(专利权)人：苏州颐坤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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