【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，具体地说，是使用微流控芯片检测3种呼吸道疾病病原体表达的特异性探针和检测技术及其应用。
技术介绍
1、呼吸系统是人类重要的生命支撑系统，而呼吸道感染是人类致病和死亡的最主要原因之一。其临床症状主要是咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、气急、呼吸困难、发热等。此外，还伴有全身症状的表现，如乏力、消瘦、失眠、心悸、盗汗等。引起呼吸道感染的病原体种类很多，包括细菌、病毒、支原体和衣原体等，尤以病毒多见，是急性呼吸道感染的重要病原体。无论引起疾病发生的病因如何，呼吸道疾病多数通过密切接触、气溶胶以及空气进行传播，且感染后其临床症状、生化测试结果、胸部病变影像都较为相似，因此诊断区分十分困难。而不同种类病原体引起的疾病治疗方法确截然不同，疗效和病程也不同。因此，为尽快明确诊断，开展相应的治疗措施，必须快速、准确地检测和鉴别病原微生物，这也有利于疾病的流行病学的调查及制定相应的预防措施。
2、人类流感病毒h1n1亚型首次出现于1918年西班牙军营，后续波及全球引发大流行。2009年3月，墨西哥和美国出现一种新型呼吸道感染病毒，即新型甲型h1n1流感病毒；2010年以后，新型h1n1逐步取代原季节性h1n1流感病毒，成为流行毒株。甲型流感病毒属于正黏病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径80-120nm，有包膜，内部存在8条单股负链rna，编码10种功能蛋白质：依赖rna的rna聚合酶pa、pb1和pb2，血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白m1和m2以及2个非结构蛋白ns1和ns2。新型甲型h1n1流感主要侵犯部位是呼吸系
3、中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome，mers)是由中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)感染所致的呼吸道传染性疾病，mers-cov是目前已知致病力最强的人类冠状病毒，最早于2012年在沙特阿拉伯被发现，主要在中东地区国家流行。该病起病迅速、来势凶猛，临床症状与sars-cov感染相似。mers-cov的中间宿主是骆驼，但其自然进化起源尚不明确。该病初期通常以急性呼吸道感染为主要表现，可有发热、寒战、乏力、纳差、咳嗽、头痛、咽喉痛、胸痛及肌肉关节痛，腹泻、恶心呕吐、腹痛等胃肠道表现也较为常见。病情严重时并发急性呼吸窘迫综合征和急性肾衰竭，导致死亡。mers-cov属冠状病毒科，β类冠状病毒的2c亚群，是一种具有包膜、基因组为线性非节段单股正链的rna病毒。病毒粒呈球形，直径为120-160nm。基因组全长约30kb，是目前已知最大的rna病毒。病毒在肺内、尿和便中存在，并且可以存在相当长的时间。针对mers，目前尚无特异性治疗方法，临床上以对症支持治疗及预防并发症为主。由于其源自未知的动物传染源，传播方式不清晰，且无有效药物与疫苗，这对全球的科学和医疗事业均是全新且艰巨的挑战。同时，mers与sars引起的疾病在临床表现相似，不易区分，因此急需研发疾病早期检测的有效手段，及时开展对症治疗，及早对疾病的爆发和流行进行预防和控制。
4、新型冠状病毒感染(covid-19)是由新型冠状病毒(sars-cov-2)感染引起的急性呼吸道传染病，以发热、干咳、乏力为主要表现。sars-cov-2主要经呼吸道飞沫和密切接触传播，潜伏期1-14天，随着变异型病原体的出现，潜伏期逐渐缩短至3-5天，人群普遍易感。sars-cov-2的4个结构蛋白基因分别为刺突糖蛋白s、囊膜蛋白e、膜蛋白m和核蛋白n。与其他β属cov不同的是，sars-cov-2的s蛋白表面暴露的受体结合结构域结构呈现一种更加活跃的开放构象，与人细胞受体血管紧张素转化酶2亲和力更高，病毒融合性更强。流行病学接触史、临床症状、肺部影像学特征性改变、实验室实时荧光定量反转录聚合酶链反应(rt-pcr)检测患者呼吸道分泌物等标本中sars-cov-2核酸是临床诊断covid-19的主要依据。核酸检测以鼻咽拭子、口咽拭子、痰液和支气管肺泡灌洗液等为主要采集标本，是实现“早发现”和“早诊断”最重要的手段和措施，也是临床上无创诊断covid-19的金标准。面对sars-cov-2高致病性及高传染性，快速确诊新型冠状病毒携带者，及时隔离传播源，是切断病毒传染的有效措施。大量报道已表明，由于患者存在个体差异，并且其病毒感染的发展阶段不同，病原学核酸检测结果假阴性概率偏高，从而导致潜在的误诊或错诊发生，引起医护人员、病人与普通人群间的交叉感染。
5、虽然上述疾病都有了相应的疫苗进行预防，但是目前已出现多种变异株，可能存在逃脱现有疫苗保护的风险。在治疗上，也大多没有特效药，主要是对症治疗。目前常通过直接从患者标本中测定病毒抗原和核酸来达到快速诊断的目的，主要的检测技术有病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等，但是检测方法各有优缺点。病毒分离鉴定敏感、准确，是流感病毒检测的金标准，但此法操作时间长，对实验室及技术要求高，不能满足流感暴发时快速检测的需要。核酸检测法(如实时荧光定量pcr法)有检测快速、敏感性和特异性高等优点，是病原性病毒确诊分析的金标准，但检测时间较长、成本较高，对实验场地、操作人员的要求也较高，在基层推广应用仍受到限制。免疫学检测(ridts和dot-elisa法)，特异性高、能实现快速筛选，可作为阳性诊断的辅助手段，灵敏度与选择性受到抗体效价影响，出现误诊或漏诊的情况。高通量测序，能确定病毒类型，但识别发现新病毒需要高配置仪器设备，且需要专业的生物信息技术人员进行分析。因此，一种检测迅速、操作简便、价廉、有较高敏感性和特异性的快速检测方法仍有待进一步研发。
6、微流控芯片(microfluidic chip)是当前微全分析系统发展的热点领域，具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，可直接将dna引物探针固定于芯片表面，样本通过与芯片上已知碱基序列的dna片段互补杂交，从而得到样品的遗传信息，确定样品的核酸序列，并可分析基因表达量。微流控芯片平行面的液体通道互相不影响，大大缩短检测时间，提升检测效率。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种微流控芯片检测方法，具有快速、准确、高灵敏度的特点，可为h1n1、mers和新冠病毒(covid-19)的快速检测和传染病防控提供一种新的技术手段。
2、本专利技术针对引起呼吸道疾病的h1n1、mers和新冠病毒快速检测实际需求，研发了微流控芯片和特异性的引物探针，该方法敏感性强，特异度高，所用试剂耗材均可常温保存，便于运输携带，尤其适合病原体现场的快速检测。
3、本专利技术的第一方面，提供一种基于微流控技术的呼吸道本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于微流控技术的呼吸道疾病病原体检测方法，其特征在于，所述的呼吸道疾病病原体为H1N1、MERS和新冠病毒；所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的呼吸道疾病病原体检测方法，其特征在于，所述的样本检测孔和阴性对照孔中预封装的检测试剂如表2所示，所述的阳性对照孔中预封装的检测试剂如表3所示：
3.根据权利要求1所述的基于微流控技术的呼吸道疾病病原体检测方法，其特征在于，步骤(C)中所述的反应条件如表4所示：
【技术特征摘要】
1.一种基于微流控技术的呼吸道疾病病原体检测方法，其特征在于，所述的呼吸道疾病病原体为h1n1、mers和新冠病毒；所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的呼吸道疾病病原体检测方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹广文，殷建华，蒲蕊，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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