【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物分离筛选，尤其涉及一种非水溶性固体有机物厌氧降解菌的快速筛分方法。
技术介绍
1、本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、非水溶性有机污染物是指在水中溶解度较低的有机污染物，包括多环芳烃、有机氯农药、多氯联苯、二噁英等。这类污染物可能来自于自然界的生物活动，如森林火灾、火山爆发等，也可能来自于人类活动，如工业排放、农业污染等。它们通常存在于土壤、底泥、大气以及动植物体中。这些污染物不仅会对环境和生态系统产生负面影响，如破坏生物多样性、污染水源和食物等，而且可能通过食物链、空气等多种途径进入人体，对人体健康产生潜在威胁。例如，一些有机氯农药可以破坏人体的神经系统和免疫系统，长期接触可能增加患癌症的风险。
3、非水溶性有机污染物的处理方法包括物理吸附法、化学氧化法、生物降解法等。其中，生物降解法是一种较为环保的方法，通过微生物的分解作用将有机污染物转化为无害物质。目前，微生物修复已经成为修复环境和去除包括多环芳烃在内许多污染物的重要技术。目前，已经发现了许多新的污染物降解菌株和酶，形成了许多新的微生物降解技术，例如固定化微生物技术、生物膜反应器技术、生物反应器系统等，这些技术可以更高效地降解污染物，同时降低了处理成本。开发出了相关菌剂，应用成本低，降解效果较好。高效降解菌种的筛分是这类技术的关键环节。地下含水层或污染土壤通常是厌氧状态，使污染带中的好氧微生物被厌氧微
4、基于琼脂培养基的菌种筛分是目前的主流手段，然而，由于非水溶性固体污染物的水溶性差，其难以与无机盐培养基以及琼脂培养基充分混匀，对于降解微生物的筛选会出现周期长、筛出机率小、筛出的降解菌系稳定性差、降解率不高等问题，从而限制了非水溶性固体有机物的菌种筛分。
5、专利cn 114058533b(授权公告日：2023.10.03)公开了一种可降解多环芳烃的硫酸盐还原菌的筛选方法，其在凝固的固体培养基上均匀涂布一定量的菲，然后在厌氧手套箱内涂布各稀释倍数的富集菌群，而后将未凝固的另一份固体培养基倾倒在在已涂布微生物的固体培养基之上，待上层固体培养基凝固后，盖上平板的上盖，将平板转移入厌氧手套箱内的培养箱在30℃及避光的条件下培养。该专利直接将非水溶性固体菲涂布到固体培养基中，菌落在培养基表面生长，生长速度较慢。此外，该专利为保证厌氧环境，涂布操作、培养过程等均在厌氧手套箱内进行，设备要求高；而且该专利的筛选周期较长。
6、专利cn 109097310b(授权公告日：2020.05.12)公开了一种降解多环芳烃-芘的厌氧型菌株及其筛选方法和应用，其在氮气气氛下向含有芘的厌氧瓶中加入已灭菌的无机盐培养基，并将10mg/l菌液悬液转移到上述无机盐培养基中恒温振荡培养，再次转接到20mg/l含芘的无机盐培养基中继续培养，如此重复，直到培养基中芘浓度为200mg/l；将最后一次的培养液进行10-1到10-9梯度稀释并涂布到lb平板培养基上，经过厌氧培养袋培养。该专利的降解菌筛选过程涉及多步转接过程，步骤繁琐，耗时长，同时由于芘不溶于水，芘在培养基中难以均匀分布，其菌落也同样在培养基表面生长，生长速度慢。
7、因此，如何提供一种筛选周期短、操作简便、无需多次转接的非水溶性固体有机物厌氧降解菌的筛分方法是亟待解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种非水溶性固体有机物厌氧降解菌的快速筛分方法，该方法对于各种非水溶性固体有机物厌氧降解菌均具有良好的适用性，且筛菌周期短、操作简便、设备要求低，适用于工业化生产。
2、本专利技术提供了一种非水溶性固体有机物厌氧降解菌的快速筛分方法，包括如下步骤：
3、(1)将非水溶性固体有机物溶液加入到厌氧培养管中，并通入氮气使溶剂挥发，以在管壁上形成非水溶性固体有机物薄膜；
4、(2)加入琼脂粉，通入co2和ar混合气，加入厌氧培养基；
5、(3)密封所述厌氧培养管，进行高压蒸汽灭菌，然后降温，置于55～65℃恒温水浴中；
6、(4)利用注射器向所述厌氧培养管中加入微生物所需成分，然后超声震荡，使所述非水溶性固体有机物薄膜脱离管壁均匀分散；
7、(5)立即接种微生物悬液，然后按10-1～10-9逐级稀释，每次稀释10倍，并将所述厌氧培养管倒置于10～20℃水浴冷却，使厌氧培养基凝固；
8、(6)将厌氧培养管置于恒温培养箱中培养，观察菌落的生长情况，获得目标有机物降解菌落；
9、(7)重复步骤(1)～(4)，立即接种高倍稀释的步骤(6)中所获得的目标有机物降解菌落；然后将所述厌氧培养管倒置于10～20℃水浴冷却，使厌氧培养基凝固；将厌氧培养管置于恒温培养箱中培养，观察菌落的生长情况，获得第二代目标有机物降解菌落；
10、(8)多次重复步骤(7)，继续纯化，直到得到具有降解效果的厌氧降解菌。
11、优选的，所述非水溶性固体有机物选自多环芳烃、多氯联苯或二噁英中的一种或多种；所述多环芳烃选自菲、芘、蒽、荧蒽或苯并(a)芘中的一种或多种。
12、优选的，步骤(1)中，所述溶剂选自丙酮、二氯甲烷或正己烷中的一种。
13、优选的，所述非水溶性固体有机物溶液的浓度为5～15mg/ml，所述非水溶性固体有机物溶液的加入量与厌氧培养管的容积比为1:200～300。
14、优选的，所述氮气的流速为30～50ml/min。
15、优选的，所述琼脂粉的加入量与厌氧培养管的容积比为2～5mg:1ml。
16、优选的，所述co2和ar混合气的流量速为20～40ml/min，co2和ar的体积比为1:2～4。
17、优选的，所述厌氧培养基的添加量与琼脂粉的添加量之比为1ml:8～10mg。所述厌氧培养基选自综合培养基、无机盐培养基或lb培养基。
18、优选的，所述高压蒸汽灭菌为：将所述厌氧培养管放入高温灭菌锅内，在120～140℃下加热10～20min。
19、优选的，步骤(4)中，所述微生物所需成分包括维生素；进一步的，所述微生物所需成分还包括硝酸盐或硫酸盐。
20、优选的，所述超声震荡的超声频率为80～100khz，温度为40～50℃，时间为10～20s。
21、优选的，所述微生物悬液的接种量与厌氧培养管的容积比为1ml：8～15ml。
22、优选的，步骤(6)中，所述恒温培养箱的温度为25～35℃，培养时间为5～7d。
23、优选的，步骤(7)中，所述高倍稀释的步骤(6)中所获得的目标有机物降解菌落，稀释倍数为10-6～10-8。
24、优选的，步骤(8)中，重复次数为4～15。
25、与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非水溶性固体有机物厌氧降解菌的快速筛分方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述非水溶性固体有机物选自多环芳烃、多氯联苯或二噁英中的一种或多种；所述多环芳烃选自菲、芘、蒽、荧蒽或苯并(a)芘中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂选自丙酮、二氯甲烷或正己烷中的一种；所述氮气的流速为30～50mL/min。
4.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述非水溶性固体有机物溶液的浓度为5～15mg/mL，所述非水溶性固体有机物溶液的加入量与厌氧培养管的容积比为1:200～300。
5.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述琼脂粉的加入量与厌氧培养管的容积比为(2～5)mg:1mL；所述CO2和Ar混合气的流量速为20～40mL/min，CO2和Ar的体积比为1:2～4。
6.如权利要求1所述的快速筛分方法，所述厌氧培养基的添加量与琼脂粉的添加量之比为1mL:8～10mg；所述厌氧培养基选自综合培养基、无机盐培养
7.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述高压蒸汽灭菌为：将所述厌氧培养管放入高温灭菌锅内，在120～140℃下加热10～20min。
8.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，步骤(4)中，所述微生物所需成分包括维生素；进一步的，所述微生物所需成分还包括硝酸盐或硫酸盐；
9.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述微生物悬液的接种量与厌氧培养管的容积比为1mL：8～15mL。
10.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，步骤(6)中，所述恒温培养箱的温度为25～35℃，培养时间为5～7d；
...【技术特征摘要】
1.一种非水溶性固体有机物厌氧降解菌的快速筛分方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述非水溶性固体有机物选自多环芳烃、多氯联苯或二噁英中的一种或多种；所述多环芳烃选自菲、芘、蒽、荧蒽或苯并(a)芘中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂选自丙酮、二氯甲烷或正己烷中的一种；所述氮气的流速为30～50ml/min。
4.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述非水溶性固体有机物溶液的浓度为5～15mg/ml，所述非水溶性固体有机物溶液的加入量与厌氧培养管的容积比为1:200～300。
5.如权利要求1所述的快速筛分方法，其特征在于，所述琼脂粉的加入量与厌氧培养管的容积比为(2～5)mg:1ml；所述co2和ar混合气的流量速为20～40ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘华清，柳隋厚，张建，薛禄，赵常杰，于群，杨鹏飞，董春晓，
申请(专利权)人：山东科技大学，
类型：发明
国别省市：
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