【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测，具体涉及一种低丰度lncrna的rt-qpcr检测方法。
技术介绍
1、小型胞外囊泡是直径约为30-150nm，来源于晚期核内体在细胞内进一步组装运输分泌至细胞外环境中的囊泡，又称外泌体。外泌体广泛存在于几乎所有的生物体液中，诸如血液、尿液、胆汁、唾液、胸腔灌洗液、腹水和细胞上清液等中，为细胞与细胞之间、细胞内与细胞外环境之间进行物质运输、信息交流和能量代谢，并参与多种疾病的发生发展。近年来，越来越多的研究表明外泌体具有多种生物功能，如维持细胞稳态、作为疾病早期诊断生物标志物、参与疾病复发耐药进程、作为药物递送载体参与疾病治疗等，而这些功能作用主要依赖于外泌体丰富的核酸、蛋白和脂质等内容物。bin hu等人研究结果表明前列腺癌细胞释放外泌体lncpca3的表达水平明显高于炎性或正常的前列腺组织，可作为有效的前列腺癌诊断生物标志物(pmid：24863945)。但是，由于血浆外泌体中lncrna(长链非编码rna，long non-coding rna)的含量较低，关于血浆外泌体lncrna的研究要远远少于血浆外泌体mirna的研究，目前血浆外泌体lncrna的研究和应用仍处于起步阶段。
2、目前，用于检测lncrna的方法主要包括northern印迹、基因芯片、rna-seq、ddpcr和rt-qpcr等。最早使用northern印迹法检测lncrna,其利用电泳技术按照片段大小来分离rna并利用能与目标片段的部分或全部序列互补的探针进行检测，但是处理过程中易导致rna样本降解，且灵敏度不
3、因此，急需一种操作简单高灵敏度的检测方法来检测血浆外泌体中低丰度的lncrna，助力外泌体lncrna在疾病诊断方面的应用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供一种低丰度lncrna的检测方法。旨在解决现有技术中rt-qpcr方法难以检测到低丰度lncrna的技术问题。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、一种低丰度lncrna的检测方法，该方法为：在待检样本rna的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过t4 rna连接酶或者smartscribetm逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cdna模板进行pcr预扩增，预扩增产物再进行rt-qpcr检测。
4、作为优选实施方案，所述接头序列是依据碱基平衡和引物特异性原则设计的长度20-40碱基的序列。
5、作为优选实施方案，所述待检样本rna为血浆外泌体lncrna。
6、作为优选实施方案，所述待检样本rna的两端加入接头序列的方法为：利用商品化的包含随机6碱基引物的smart pico oligos mix或包含lan-tso接头的templateswitching oligo mix加入接头序列。smart pico oligos mix可采用clontech公司的635005试剂盒产品；包含lan-tso接头的template switching oligo mix可采用takara或表观生物公司的商品化产品。使用商品化的接头序列，需要与其试剂盒产品中的引物配套使用。
7、本专利技术还提供一种低丰度lncrna的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
8、步骤1，向待检测rna样本中加入smart pico oligos mix，混匀，70-75℃孵育2-4min进行退火，结束后置于-5-5℃；
9、步骤2，向步骤1反应结束后的体系中加入一链合成混合液合成cdna，所述一链合成混合液的组成为：5x一链缓冲液、模板切换oligo mix、rnase抑制剂、smartscribe逆转录酶；
10、步骤3，向步骤2的cdna产物体系中加入配制好的pcr扩增混合液和引物进行cdna模板预扩增，所述pcr扩增混合液的组成为：2x seqamp pcr缓冲液、seqamp dna聚合酶、无酶水；
11、步骤4，设计低丰度lncrna引物，以步骤3的cdna模板预扩增产物为模板，配制rt-qpcr反应体系，进行扩增检测。
12、作为优选实施方案，所述方法用于检测血浆外泌体中的snhg8或fgd5-as1。
13、作为优选实施方案，检测snhg8基因的引物为seq id no:1所示的上游引物和seqid no:2所示的下游引物。
14、作为优选实施方案，检测fgd5-as1基因的引物为seq id no:3所示的上游引物和seq id no:4所示的下游引物。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
16、1，本专利技术对常规rt-qpcr技术进行改进，使得血浆小型胞外囊泡低丰度的lncrna能够被检测出来，不仅降低了临床医疗生物样本收集难度，也减少患者额外的痛苦，为血浆小型胞外囊泡lncrna在临床诊断、转化医学研究等方面的应用奠定坚实的基础。
17、2，本专利技术发现血浆小型胞外囊泡snhg8和fgd5-as1无法通过常规rt-qpcr检测出来；通过本专利技术检测方法则能够检出snhg8和fgd5-a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，该方法为：在待检样本RNA的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过T4 RNA连接酶或者SMARTScribeTM逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cDNA模板进行PCR预扩增，预扩增产物再进行RT-qPCR检测。
2.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述接头序列是依据碱基平衡和引物特异性原则设计的长度20-40碱基的序列。
3.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述待检样本RNA为血浆外泌体lncRNA。
4.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，所述待检样本RNA的两端加入接头序列的方法为：利用商品化的包含随机6碱基引物的SMART Pico Oligos Mix或包含LAN-TSO接头的Template Switching Oligo Mix加入接头序列。
5.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：>
6.根据权利要求1-5任一项所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述方法用于检测血浆外泌体中的SNHG8或FGD5-AS1。
7.根据权利要求6所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：检测SNHG8基因的引物为SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
8.根据权利要求6所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：检测FGD5-AS1基因的引物为SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物。
...【技术特征摘要】
1.一种低丰度lncrna的检测方法，其特征在于，该方法为：在待检样本rna的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过t4 rna连接酶或者smartscribetm逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cdna模板进行pcr预扩增，预扩增产物再进行rt-qpcr检测。
2.根据权利要求1所述的低丰度lncrna的检测方法，其特征在于：所述接头序列是依据碱基平衡和引物特异性原则设计的长度20-40碱基的序列。
3.根据权利要求1所述的低丰度lncrna的检测方法，其特征在于：所述待检样本rna为血浆外泌体lncrna。
4.根据权利要求1所述的低丰度lncrna的检测方法，其特征在于，所述待检样本rna的两端加入接头序列的方法为：利用商品化的包含随机6碱基引物的smart...
【专利技术属性】
技术研发人员：许晓雅，张大东，李志宽，陈升，年宝宁，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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