【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开提供了通过向重组腺相关病毒(aav)产生培养基中添加某些盐，特别是钙盐，例如氯化钙来制备aav载体的方法。
技术介绍
0、技术背景
1、腺相关病毒(aav)是一种复制缺陷型细小病毒。aav颗粒包含具有三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)的衣壳，包封长度约为4.8kb的单链dna基因组，所述基因组可以是正链或负链。含有任一链的颗粒都具有感染性，并且通过将亲本感染单链转化为双链体形式并随后扩增来发生复制，后代单链由此被置换并包装成衣壳。
2、aav依赖于与其它病毒(主要是腺病毒)的共同感染来进行复制。其单链基因组含有三个基因，rep(复制)、cap(衣壳)和aap(组装)，所述基因通过使用三个启动子、替代翻译起始位点和差异剪接产生至少九种基因产物。这些编码序列的两侧是基因组复制和包装所需的反向末端重复序列(itr)。rep基因编码四种蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)，它们参与病毒基因组复制和包装，而cap表达产生病毒衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)，它们形成保护病毒基因组的衣壳外壳，并积极参与细胞结合和内化。aap基因在与cap基因重叠的替代阅读框中编码组装激活蛋白(aap)。认为这种aap蛋白为衣壳组装提供了支架功能。
3、aav颗粒具有使其作为包括基因疗法和遗传疫苗等治疗应用的载体有吸引力的特征。aav感染多种细胞类型，包括许多哺乳动物细胞，因此有可能靶向体内许多不同的组织。aav感染缓慢分裂和非分裂细胞。对于治疗应用，使用重组aav(raav)，其中基因组包含
4、用于产生raav载体的细胞培养系统包括人类细胞系的瞬时转染和哺乳动物或昆虫细胞系的感染。raav载体生成方法通常包括为载体生成提供生物合成机制的产生细胞类型，与辅助载体(例如辅助质粒、辅助病毒)组合作为raav复制和包装所需的额外基因产物的来源。
5、raav载体产生方法的重要目标是实现一致、高的载体产生率，同时最大限度地减少与产品相关的杂质的产生，所述杂质包括aav衣壳化残余dna杂质和空衣壳。以每个细胞产生的载体基因组(vg)来测量，raav载体产生力可能变化很大，从每个细胞少于103至2×105vg不等。除了更高的成本效益之外，高生产率的一个重要优势是，当起始材料中raav载体产物与总收获生物量的比率较高时，纯化可更有效。
6、产物相关杂质类似于raav载体本身，并且在纯化过程中不易与raav载体分离。在当前的raav载体产生系统中，aav空衣壳以高水平产生。对于aav2，细胞培养物中产生的总aav颗粒的50％至95％是空衣壳。然而，为了限制对aav衣壳的潜在有害免疫反应，谨慎的做法是尽量减少细胞培养物中空衣壳的产生和/或在载体纯化过程中将其基本上去除。因此，需要增加raav产生力和/或减少产物相关杂质，例如空衣壳的方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供了通过向aav产生培养基中添加某些盐，特别是钙盐，例如氯化钙来产生重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法。本文描述了一种用于产生重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法，其中所述方法包括：
2、(i)扩增阶段，其包括增加至少一个含有培养基的培养容器中的细胞数量；
3、(ii)将包含侧接aav反向末端重复序列(itr)的转基因的第一多核苷酸序列和任选的包含aav rep和cap基因的第二多核苷酸序列和/或包含一个或多个辅助基因的第三多核苷酸序列引入细胞中；
4、(iii)产生阶段(其中产生raav颗粒)，其包括培养来自步骤(ii)的细胞并在引入第一多核苷酸序列之后约0至约24小时向培养基中添加钙(ca)离子(即ca2+的盐)，使得培养基中ca离子的总浓度大于0.3mm且小于10mm；和
5、(iv)分离raav颗粒。
6、在所述方法的实施方案中，向培养基添加ca离子包括添加ca盐，例如cacl2。可添加钙离子至培养基中的ca离子浓度为约0.5mm至约9mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、或约2mm至约4mm。在实施方案中，添加钙离子至浓度为约1mm、约1.5mm、约2mm、约2.5mm、约3mm、约3.5mm、约4mm、约4.5mm、约5mm、约5.5mm、约6mm、约6.5mm、约7mm、约7.5mm、约8mm、约8.5mm、约9或约9.5mm。在实施方案中，向产生培养基中添加钙离子至约0.5mm至约6mm；约2mm至约6mm、约2mm至约4mm、或约1mm至约3mm的浓度。
7、在一些实施方案中，ca离子(ca盐，例如cacl2)在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者之后或在产生阶段开始时(即，在引入后约0小时时)添加。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列之后或在产生阶段开始之后约0小时至约24小时(例如0、约1、约2、约5、约8、约12、约18、约23、约24、约24.5小时)的任何时间添加ca离子。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列之后或在产生阶段开始之后约0小时至约18小时的任何时间添加ca离子。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列或产生阶段开始之后约6小时至约20小时、约6小时至约18小时、或约6至约12小时的任何时间添加ca离子。在一些实施方案中，在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者(或产生阶段开始)之后约12小时添加ca离子，使得培养基中ca的总浓度为约2mm。
8、在所述方法的实施方案中，扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基是无血清的。在实施方案中，扩增和/或产生阶段包括将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者添加至扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基中。谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者可以是例如l-丙氨酰基-l-谷氨酰胺、l-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-l-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、l-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。可例如在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时和/或约72小时中的一者或多者时在产生阶段开始之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时和/或约72小时中的一者或多者时将包含谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者的溶液添加至产生阶段培养基中。
9、在所述方法的实施方案中，扩增阶段和/或产生阶段包括向扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基添加抗结块补充剂。在实施方案中，抗结块补充剂包含硫酸葡聚糖、肝素和/或抑制细胞聚集的其它硫酸化糖胺聚糖。在实施方案中，抗结块补充剂包含肝素钠，其可以约25μg/ml至约2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中向所述产生阶段培养基中添加Ca离子包括添加钙盐。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述钙盐包括CaCl2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中添加所述Ca离子至约0.5mM至约6mM的浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM至约6mM的浓度。
6.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM至约4mM的浓度。
7.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约1mM至约3mM的浓度。
8.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM的浓度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后约0小时至约24小时将所述Ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
10.如权利要求4所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时至约18小时将所述Ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
11.根据权利要求1至3中
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述产生阶段(步骤iii)为至少约48小时、约72小时至约100小时、约90小时至约100小时、约92小时至约98小时、约94至约98小时、或约96小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述产生阶段包括向所述产生阶段培养基中添加以下中的一者或多者：(a)谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽；和/或(b)山梨醇。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者选自L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、L-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。
15.如权利要求13所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时中的一个或多个时间将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者添加至所述培养基中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中将抗结块补充剂添加至所述培养基中。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中通过包括所述第一、第二和第三多核苷酸序列的一种或多种载体的转染，通过用包括所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的一者或多者的一种或多种病毒感染，通过所述一种或多种载体的转染和所述一种或多种病毒的感染的组合，或通过用所述第一、第二和第三多核苷酸序列进行电穿孔，将所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入所述细胞中。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过转染将所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入所述细胞中。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述转基因编码治疗蛋白或报告蛋白。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述转基因选自由以下组成的组：RPE65、RPGR、GAD65、GAD67和CNGB3。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述AAV cap基因来自选自由以下组成的组的AAV血清型或AAV变体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-PHP.5、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV2-retro、AAV9-retro和其混合体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述细胞在悬浮液中培养。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一个培养容器是摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述培养基具有约7.2至约7.4的pH并且培养所述细胞包括CO2鼓泡。
28.如权利要求27所述的方法，其中在步骤(ii)之前，将所述培养基的pH改变至约6.9并且停止CO2鼓泡。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中向所述产生阶段培养基中添加ca离子包括添加钙盐。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述钙盐包括cacl2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中添加所述ca离子至约0.5mm至约6mm的浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其中添加所述ca离子至约2mm至约6mm的浓度。
6.如权利要求4所述的方法，其中添加所述ca离子至约2mm至约4mm的浓度。
7.如权利要求4所述的方法，其中添加所述ca离子至约1mm至约3mm的浓度。
8.如权利要求4所述的方法，其中添加所述ca离子至约2mm的浓度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后约0小时至约24小时将所述ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
10.如权利要求4所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时至约18小时将所述ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后约12小时添加ca离子至所述培养基中的ca离子浓度为约2mm。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述产生阶段(步骤iii)为至少约48小时、约72小时至约100小时、约90小时至约100小时、约92小时至约98小时、约94至约98小时、或约96小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述产生阶段包括向所述产生阶段培养基中添加以下中的一者或多者：(a)谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽；和/或(b)山梨醇。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者选自l-丙氨酰基-l-谷氨酰胺、l-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-l-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、l-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。
15.如权利要求13所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时中的一个或多个时间将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者添加至所述培养基中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中将抗结块补充剂添加至所述培养基中。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中通过包括所述第一、第二和第三多核苷酸序列的一种或多种载体的转染...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·齐奥帕，A·瓦琳哈斯，B·李维斯，
申请(专利权)人：梅里特斯英国第二有限公司，
类型：发明
国别省市：
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