【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及宿主因子snapin在狂犬病病毒新型疫苗和救治药物研制中的应用。
技术介绍
1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,rabv)引起的一种严重的嗜神经性人畜共患病，目前尚无有效的临床治疗方法，一旦出现临床症状，病死率高达100％。据who统计，每年全球因狂犬病死亡的人数约60000人，给世界公共卫生安全造成了巨大威胁。鉴于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，故应加强预防接种以控制疾病的蔓延及筛选新型狂犬病治疗靶点和救治药物对于狂犬病的综合防控和临床治疗具有重要意义。
2、rabv属于弹状病毒科、狂犬病毒属的单股负链的rna病毒，从3'到5'端分别编码核蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、糖蛋白(g)和rna依赖的rna聚合酶蛋白(l)五种结构蛋白，这五种结构蛋白共同调节病毒的复制、转录、组装和出芽等过程。rabv作为嗜神经性病毒，感染的关键因素在于保护轴突、树突及突触的完整性。而宿主蛋白snapin是突触小体相关蛋白，在生物进化中高度保守，在大脑皮质、海马体、小脑、下丘脑及脊髓等神经元中均有表达，有研究表明在snapin基因缺失的神经元中，其晚期逆向运输受到抑制，造成细胞器的显著积累，导致神经元活力降低，树突发育缺陷和轴突肿胀。但是关于snapin蛋白是否影响rabv的复制目前尚未见报道。
技术实现思路
1、为了研究宿主因子snapin对rabv复制的影响，进一步为狂犬病病毒疫苗及狂犬病治疗靶点筛选的研究奠定基础，本专利技术通过过
2、为解决上述技术问题，并实现相应的技术效果，本专利技术提出了如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供过表达鼠源宿主因子snapin在促进狂犬病病毒复制中的应用，所述鼠源宿主因子snapin的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术的第二个目的是提供一种重组狂犬病病毒rcvs11-snapin的构建方法，该方法包括如下步骤：
5、(1)将人工优化后的snapin基因序列插入到狂犬病病毒cvs11全基因组的g基因和l基因之间获得重组质粒cvs11-snapin；所述人工优化后的snapin基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；
6、(2)将步骤(1)获得的重组质粒与辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g共转染bsr细胞，经培养收获上清，即得重组狂犬病病毒rcvs11-snapin。
7、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是在人工优化后的snapin基因的两端分别添加bsiw i、sac ii酶切位点，双酶切后插入至cvs11质粒，得重组质粒cvs11-snapin。
8、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)的具体方法是将人工优化后的snapin基因插入到pcdna3.1载体中获得重组表达质粒pcdna3.1-snapin，利用分别引入bsiw i、sac ii酶切位点的上下游引物对重组表达质粒pcdna3.1-snapin进行扩增，经胶回收获得目的片段；用限制性内切酶bsiw i与sac ii对cvs11载体进行双酶切，经纯化回收获得酶切产物；采用无缝连接酶对目的片段及酶切产物进行连接即得重组质粒cvs11-snapin。
9、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g的用量之比为10:5:2:3。
10、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g的用量分别为0.625μg，0.3125μg，0.125μg，0.1875μg。
11、本专利技术的第三个目的是提供上述构建方法构建获得的重组狂犬病病毒rcvs11-snapin。
12、本专利技术的第四个目的是提供上述重组狂犬病病毒rcvs11-snapin在制备狂犬病病毒疫苗中的应用。
13、本专利技术的第五个目的是提供敲低鼠源宿主因子snapin在抑制狂犬病病毒复制中的应用，所述鼠源宿主因子snapin的氨基酸序列如seq id no.2所示。
14、本专利技术的第六个目的是提供能够抑制鼠源宿主因子snapin表达的物质在制备用于治疗狂犬病的药物中的应用，所述鼠源宿主因子snapin的氨基酸序列如seq id no.2所示。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述能够抑制鼠源宿主因子snapin表达的物质为敲低鼠源宿主因子snapin的物质。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述敲低鼠源宿主因子snapin的物质为三条靶向snapin mrna不同位点的sirna sisnapin1、sisnapin2和sisnapin3的混合，sisnapin1的正义链序列如seq id no.3所示，反义链序列如seq id no.4所示，sisnapin2的正义链序列如seq id no.5所示，反义链序列如seq id no.6所示，sisnapin3的正义链序列如seq idno.7所示，反义链序列如seq id no.8所示。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术通过过表达snapin基因及敲低snapin基因证实了宿主因子snapin作为正向调控因子促进rabv复制，进而本专利技术构建了一种表达外源蛋白snapin的重组狂犬病病毒rcvs11-snapin，并发现该重组病毒与母本毒株cvs11相比具有更高的体外增殖特性，可用于制备狂犬病疫苗。此外，本专利技术还发现敲低宿主因子snapin能够抑制狂犬病病毒的复制，宿主因子snapin可作为治疗狂犬病的新的靶点。
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1.过表达鼠源宿主因子Snapin在促进狂犬病病毒复制中的应用，其特征在于，所述鼠源宿主因子Snapin的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组狂犬病病毒rCVS11-Snapin的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是将人工优化后的Snapin基因插入到pcDNA3.1载体中获得重组表达质粒pcDNA3.1-Snapin，利用分别引入Bsiw I、Sac II酶切位点的上下游引物对重组表达质粒pcDNA3.1-Snapin进行扩增，经胶回收获得目的片段；用限制性内切酶Bsiw I与Sac II对狂犬病病毒CVS11株全长质粒进行双酶切，经纯化回收获得酶切产物；采用无缝连接酶对目的片段及酶切产物进行连接即得重组质粒CVS11-Snapin。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中辅助质粒pD-N、pD-P、pD-L、pD-G的用量之比为10:5:2:3。
5.权利要求2-4任一所述的构建方法构建获得的重组狂犬病病毒rCVS11-S
6.权利要求5所述重组狂犬病病毒rCVS11-Snapin在制备狂犬病病毒疫苗中的应用。
7.敲低鼠源宿主因子Snapin在抑制狂犬病病毒复制中的应用，其特征在于，所述鼠源宿主因子Snapin的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.能够抑制鼠源宿主因子Snapin表达的物质在制备用于治疗狂犬病的药物中的应用，其特征在于，所述鼠源宿主因子Snapin的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述能够抑制鼠源宿主因子Snapin表达的物质为敲低鼠源宿主因子Snapin的物质。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述敲低鼠源宿主因子Snapin的物质为三条靶向Snapin mRNA不同位点的siRNA siSnapin1、siSnapin2和siSnapin3的混合，siSnapin1的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示，siSnapin2的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示，siSnapin3的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
...【技术特征摘要】
1.过表达鼠源宿主因子snapin在促进狂犬病病毒复制中的应用，其特征在于，所述鼠源宿主因子snapin的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.一种重组狂犬病病毒rcvs11-snapin的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是将人工优化后的snapin基因插入到pcdna3.1载体中获得重组表达质粒pcdna3.1-snapin，利用分别引入bsiw i、sac ii酶切位点的上下游引物对重组表达质粒pcdna3.1-snapin进行扩增，经胶回收获得目的片段；用限制性内切酶bsiw i与sac ii对狂犬病病毒cvs11株全长质粒进行双酶切，经纯化回收获得酶切产物；采用无缝连接酶对目的片段及酶切产物进行连接即得重组质粒cvs11-snapin。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g的用量之比为10:5:2:3。
5.权利要求2-4任一所述的构建方法构建获得的重组狂犬病病毒rcvs11-snapin。
6.权利要求5所述重组狂犬病病...
【专利技术属性】
技术研发人员：王化磊，张海丽，白玉洁，黄培，李媛媛，金宏丽，黄静波，柳永赛，刘星岐，焦翠翠，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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