【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传工程领域，具体是一种适用于四种转基因大豆品系及其转化体成分的核酸斑点杂交检测方法，属于食品安全，转基因检测领域。
技术介绍
1、全球四大转基因种植品种包括大豆、玉米、棉花、油菜。截止2019年，四大品种种植面积占全球转基因总种植面积99.1％，占比从高到低依次为大豆48.3％、玉米32.0％、棉花13.5％、油菜5.3％。其中，转基因大豆的应用率最高，达到了94％，大豆是全球最早实现转基因技术商业化应用的农作物，超过35个国家进行商业化种植，年种植面积近1亿公顷，占转基因作物总面积的一半以上。目前全球(71个国家/地区)共批准转基因大豆品种及转化体39个，主要性状包括耐除草剂、抗虫、抗旱、高油酸等，耐除草剂品种仍然是转基因大豆的主体性状。随着国民生活质量的提高，我国进口转基因大豆的总量不断攀升，现已成为世界上最大的转基因大豆进口国，海关数据显示，2020年我国总计进口大豆10032.73万吨，首次突破1亿吨关口，主要用于食用油和豆粕原料.其中80-90％的食用油是由转基因大豆加工而来。
2、我国现已研发出g2epsp、g10evo-epsps等具有耐除草、抗虫等应用价值的功能基因，并将其应用到转基因作物的构建上，现中黄6106、shzd3201、zuts-33等多个转化体已获得生产应用安全证书，相关抗除草剂大豆已进入国家审定阶段，稳步推进我国转基因大豆的商业化种植进程。由于转化体的分子特征、环境安全和食用安全评价技术体系仍然存在缺陷，转基因技术和转基因大豆食品的安全性备受各方广泛关注[6-9]。因此
3、当前转基因检测技术日趋成熟，从基于蛋白的免疫分析检测技术，到基于核酸的pcr检测技术，以及逐渐发展起来的多重实时荧光pcr技术，在转基因成分筛查和转基因作物品系鉴定方面都有很好的应用。核酸斑点杂交技术是利用已标记的探针与点在尼龙膜上的待测的变性dna杂交，由于核酸探针上带有标记物可与特异靶分子结合，通过洗膜，显影等过程进行显色反应，从而判断待测样品中是否含有特殊的靶序列，可用于转基因作物品系鉴定，动植物疫病检测中。如梁彦君等传统定性pcr技术和核酸斑点杂交技术对转基因番茄的内源基因以及启动子、终止子和报告基因等外源基因进行检测，在阳性质粒和华番一号转基因番茄样本中四种基因均检出，方法重复性好，灵敏度高。刘亚琪使用传统定性pcr技术和核酸斑点杂交技术对禽戊型肝炎病毒的orf2，构建了阳性质粒，合成了地高辛标记核酸探针，扩增产物不需电泳直接点于尼龙膜上，与标记的核酸探针进行杂交及显色反应，灵敏度可达到10pg/μl。由于核酸斑点杂交技术试验过程不依赖大型设备，检测结果易观察，一次可检测多个样品，适合于大批量样品的检测。
4、dp305423是杜邦先锋公司2009年研发的转入了fad2-1,cp4-epsps基因后，具有高油酸和耐草甘膦性状，das68146、das81419，das44406均是由陶氏益农公司2012-2013年研发的，其中dnas68146转入了aad-12和pat基因后而具有耐草铵膦和耐2,4-d除草剂性状，das44406转入了aad-12、pat和2mepsps基因后而同时具有耐草铵膦、耐草甘膦和耐2,4-d除草剂性状；das81419转入了cry1ac、cry1f和pat基因而具有抗虫和耐草甘膦性状。这四种转基因大豆品系均已获得我国的进口许可，但仅能用于动物饲料和粮油加工。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用核酸斑点杂交方法检测转基因大豆品系及其转化体成分的方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定所用的引物：
3、大豆内源基因lectin的扩增引物为：
4、lectin-前引物：gacactaagccacaaacac
5、lectin-后引物：tggaggcatcataggtaat
6、转基因大豆品系das-68416-4的扩增引物为：
7、das-68416-4-前引物：ccgctacttgctcttgt
8、das-68416-4-后引物：atgatgctgactggtgc
9、转基因大豆品系das-44406-6的扩增引物为：
10、das-44406-6-前引物：tatgtgtgataatgtcatggg
11、das-44406-6-后引物：aatttggcctgtagacctca
12、转基因大豆品系das-81419的扩增引物为：
13、das-81419-前引物：tgaagaaaatccaaccat
14、das-81419-后引物：aagcgacttagtgatgagc
15、转基因大豆品系dp305423的扩增引物为：
16、dp305423-前引物：gaataaaggaagtacagtagaat
17、dp305423-后引物：aaaggatgcgtatagagtaa。
18、本专利技术还同时提供了一种利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：
19、①基因组dna提取；
20、②靶标筛选和引物设计；
21、③定性pcr扩增检测；
22、④杂交膜的准备；
23、⑤生物素探针的制备；
24、⑥杂交；
25、⑦显色与结果判定。
26、作为本专利技术的快速鉴定的方法的改进：
27、步骤②的定性pcr结合的核酸斑点杂交方法扩增所需的引物如上所述。
28、作为本专利技术的快速鉴定的方法的进一步改进，所述步骤③中：
29、反应体系为10×buffer 2.5μl,dntp 2μl,taqhs 0.125μl，上下游引物0.8μl，各模板3μl，加双蒸水补足至25μl；
30、反应程序：98℃预变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃总延伸5min。扩增结束后，取5μl扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因扩增情况。
31、作为本专利技术的快速鉴定的方法的进一步改进，所述步骤④中，先将正电尼龙膜用灭菌双蒸水浸泡(浸泡时间约为10±5min)，再用20×ssc浸泡30min～2h，晾干；
32、将pcr产物(20μl)沸水浴变性5±0.5min，冰中速冷5±0.5min，于尼龙膜毛面进行点样，每个样品设置三个平行，每个平行点5μl(每次点1μl，重复5次，防止样品扩散范围过大，影响其他样品显色)；将点样后的尼龙膜置于干净的滤纸上，室温干燥0.5-1h后，80℃真空干燥固定2h，得杂交膜(密封保存备用)。...
【技术保护点】
1.利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定所用的引物，其特征是：
2.利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的快速鉴定的方法，其特征是：
4.根据权利要求2或3所述的快速鉴定的方法，其特征是所述步骤③中：
5.根据权利要求4所述的快速鉴定的方法，其特征是：
6.根据权利要求5所述的快速鉴定的方法，其特征是：
7.根据权利要求6所述的快速鉴定的方法，其特征是：
8.根据权利要求2～7任一所述的快速鉴定的方法，其特征是：
9.根据权利要求2～8任一所述的快速鉴定的方法，其特征是：
10.根据权利要求2所述的快速鉴定的方法，其特征是：
【技术特征摘要】
1.利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定所用的引物，其特征是：
2.利用核酸斑点杂交方法对转基因大豆品系及其转化体成分进行快速鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的快速鉴定的方法，其特征是：
4.根据权利要求2或3所述的快速鉴定的方法，其特征是所述步骤③中：
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王凤军，葛越，郑如福，林洁洁，陈显显，唐琳，汤雅棉，
申请(专利权)人：浙江经贸职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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