【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种lbcpf1蛋白的表达及其纯化方法和应用。
技术介绍
1、crispr技术和相关crispr(cas)蛋白为基因调控和基因组工程提供了强大的工具，不仅用于在基因编辑领域，而且在分子诊断方面也有极大的应用潜力。基于cas蛋白的反式切割效应，已经开发出许多功能强大的crispr诊断方法，甚至可以区分单核苷酸多态性(snp)。其中lbcpf1蛋白应用最为广泛，可在crrna介导下结合靶标双链dna(dsdna)序列，激活顺式切割活性，同时在非特异性靶标单链dna(ssdna)上显示出非特异性的反式切割活性，并且lbcpf1蛋白的反式切割活性适用于开发检测病毒或者基因组突变位点的dsdna靶标序列检测。然后为制备满足所需纯度的lbcpf1蛋白，需要对重组表达蛋白进行提取和纯化。现有技术中最常以商品化表达质粒6his-mbp-tev-hulbcpf1制备lbcpf1蛋白，多存在纯化周期长、操作复杂、成本高和纯度低等问题。专利cn114480347a中公开一种通过两次镍柱与肝素柱组合纯化cas12a(cpf1)蛋白的方法，但该方法耗时约36h，且表明一次镍柱加分子筛纯化时无法去除cas12a蛋白的高聚物，从而影响纯化效果，并且该方法操作复杂，成本较高，无法实现在较短周期内获得高纯化cas12a蛋白。
技术实现思路
1、本专利技术为解决现有lbcpf1蛋白表达及纯化技术中存在周期长、操作复杂、成本高和纯化效果较差的技术问题，本专利技术提供一种lbcpf1蛋白的表达
2、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
3、本专利技术的目的之一在于提供一种lbcpf1蛋白的表达及纯化方法，所述方法包括以下步骤：
4、通过表达载体表达带有his标签的lbcpf1蛋白，经离心后获得含lbcpf1蛋白的上清液，然后使用单次镍柱和超滤浓缩管对上述lbcpf1蛋白上清液进行纯化及浓缩，获得纯化后的lbcpf1蛋白。
5、进一步限定，所述的表达载体质粒为pet28a-sumo。
6、进一步限定，所述的his标签连接在lbcpf1蛋白的n-末端或c-末端。
7、进一步限定，所述的lbcpf1蛋白包括seq id no.1所示的氨基酸序列。
8、进一步限定，所述的镍柱为镍离子亲和层析柱。
9、进一步限定，所述的超滤管的截留分子量为30kda。
10、进一步限定，所述的单次镍柱纯化步骤中，使用缓冲液a进行水洗，使用缓冲液b和缓冲液c以1.0-2.0ml/min进行线性洗脱；所述缓冲液ph值为ph＝7.5-8.2。
11、更进一步限定，所述的缓冲液a包含50mm trishcl，ph＝7.5，20mm咪唑，500mmnacl，0.5mm tcep；
12、所述的缓冲液b包含40-50mm trishcl、20-60mm咪唑、300-500mm nacl和0.4-0.6mm tcep；
13、所述的缓冲液c包含40-50mm tris hcl、280-320mm咪唑、300-500mm nacl和0.4-0.6mm tcep。
14、本专利技术的目的之二在于提供一种按照上述方法获得的lbcpf1蛋白。
15、本专利技术的目的之三在于提供一种按照上述方法获得的lbcpf1蛋白在猫疱疹病毒检测中的应用。
16、本专利技术的有益效果：
17、1、本专利技术以pet28a-sumo质粒为lbcpf1蛋白表达载体，采用单次镍柱对lbcpf1蛋白进行纯化处理，其中镍柱为镍离子亲和层析柱，具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，结合超滤管对经过镍柱纯化后的lbcpf1蛋白进一步纯化浓缩，其目的在于浓缩lbcpf1蛋白及滤掉小分子杂蛋白，从而提高lbcpf1蛋白纯度，并且发现pet28a-sumo质粒在lbcpf1蛋白纯化过程中发挥一定的作用，使得本专利技术纯化后的lbcpf1蛋白相较于传统纯化方法获得的lbcpf1蛋白，具有更高的lbcpf1蛋白质量，纯化效果更好，具体表现为：
18、(1)具有较高的蛋白纯度，本专利技术表达及纯化的lbcpf1蛋白纯度为94.55％，是传统纯化方法获得的lbcpf1蛋白纯度的1.55倍，是商品化lbcpf1蛋白纯度的1.4倍；
19、(2)具有较高的蛋白活性，本专利技术表达及纯化的lbcpf1蛋白活性远远高于传统单次镍柱纯化方法获得的lbcpf1蛋白活性，与商品化lbcpf1蛋白活性相近，具有较好的商品性。
20、2、本专利技术提供的纯化方法减少了现有同类技术中对镍柱的使用次数，避免了最为费时费力和极易造成蛋白损耗的蛋白标签切除、肝素柱破除高聚体和凝胶过滤纯化等步骤，简化了蛋白纯化步骤，同时降低了蛋白纯化成本；本专利技术提供的蛋白纯化时间约为20h，相较于传统单次镍柱纯化方法的蛋白纯化时间缩短了12h，提高了蛋白纯化效率，降低了因纯化时间过长造成的蛋白损耗，从而提高了蛋白纯化质量，达到了在短周期内高效、高质量纯化lbcpf1蛋白。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体质粒为pET28a-SUMO。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的His标签连接在LbCpf1蛋白的N-末端或C-末端。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LbCpf1蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的镍柱为镍离子亲和层析柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤管的截留分子量为30kDa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单次镍柱纯化步骤中，使用缓冲液A进行水洗，使用缓冲液B和缓冲液C以1.0-2.0mL/min进行线性洗脱；所述缓冲液pH值为pH＝7.5-8.2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液A包含50mM Tris HCl，pH＝7.5，20mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP；
9
10.权利要求1-8任一项所述的方法获得的LbCpf1蛋白在猫疱疹病毒检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种lbcpf1蛋白的表达及其纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体质粒为pet28a-sumo。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的his标签连接在lbcpf1蛋白的n-末端或c-末端。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的lbcpf1蛋白包括seq id no.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的镍柱为镍离子亲和层析柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤管的截...
【专利技术属性】
技术研发人员：王化磊，黄赞恒，黄培，李媛媛，张海丽，白玉洁，金宏丽，靳凯凯，刘美慧，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。