【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测，具体涉及用于检测猴痘病毒的引物对、引物组合物、方法和试剂盒。
技术介绍
1、猴痘是由猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)感染引起的人畜共患疾病。临床上主要表现为发热、皮疹、淋巴结肿大。mpxv属于痘病毒科正痘病毒属，是一种有包膜的双链dna病毒。该病主要通过动物传播，人类可以被感染动物的咬伤或者直接接触感染动物的血液、体液和皮疹而感染猴痘，其潜伏期通常为7至14天，症状持续时间2至4周，致死率在0％～11％之间，绝大多数患者可康复。目前还没有针对mpxv的针对性治疗方案。因此，准确的检测对于早期发现病例、快速鉴别诊断和控制病毒传播至关重要。
2、目前，mpxv感染的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、电镜活检、血清学免疫检测、分子生物学检测等，其中，最常使用的方法为基于taqman探针的荧光定量pcr法。该技术主要利用了taq酶的5′外切酶活性。首先合成一个能与pcr产物杂交的探针，探针的5′端标记一种荧光分子，3′标记一种相应的荧光淬灭分子，3′端淬灭分子能够吸收5′端荧光分子发出的荧光。正常情况下该探针理论上不发出荧光，但当溶液中有pcr产物时，探针与pcr产物结合，激活taq酶的5′端外切酶活性，将探针切割成单核苷酸，与此同时，标记在探针上的荧光基团游离出来，导致发出荧光，且切割的荧光分子数与pcr产物的数量成正比。因此，根据pcr反应液中荧光信号强度即可计算出初始模板的浓度。taqman探针技术尽管应用广泛，但仍存在一些缺陷，如线性探针的长度限制了能量转移效率，淬
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种猴痘病毒的检测方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的引物对，所述引物对由mpxv-f和mpxv-r组成，所述mpxv-f为核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子，所述mpxv-r为核苷酸序列是seqid no.2的单链dna分子。
4、本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括mpxv正义链探针mpxv-p1、mpxv反义链探针mpxv-p2、前述mpxv-f和mpxv-r，所述mpxv-p1为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna分子，所述mpxv-p2为核苷酸序列是seq id no.4的单链dna分子。
5、进一步地，上述引物探针组合物中，所述mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpxv-p2的5’端标记荧光基团，3’端修饰有mgb。
6、进一步地，上述引物探针组合物中还包括人管家基因gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探针gpi-p。其中gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探针gpi-p的摩尔比为7：7：6。
7、进一步地，上述引物探针组合物中，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpxv-p2的摩尔比为2:2:1:1。
8、进一步地，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpxv-p2、gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探针gpi-p的摩尔比为0.72:0.72:0.36:0.36:0.07:0.07:0.06。
9、本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的试剂盒，所述试剂盒包含前述的引物对或包含前述的引物探针组合物。
10、进一步地，上述试剂盒中还包括dntp、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。
11、进一步地，上述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为monkeypox virus-f3l假病毒，monkeypox virus-f3l假病毒是将猴痘病毒的部分dna序列构建到病毒样颗粒载体(virus like particles，vlps)载体上得到的，阴性对照品为生理盐水。
12、本专利技术提供了检测猴痘病毒的方法，所述方法包括使用前述引物探针组合物对待测样品进行pcr扩增反应，根据扩增结果确定待测样品是否含有猴痘病毒。
13、进一步地，上述方法中，所述pcr扩增反应中的所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpxv-p2的摩尔比为2:2:1:1。
14、进一步地，上述方法中，pcr扩增反应的退火温度为55℃。
15、上述方法中，所述待测样品可包括疱液、口咽拭子、唾液或尿液样本。
16、前述引物对或引物探针组合物在检测猴痘病毒或制备检测猴痘病毒的产品中的应用也属于本专利技术保护的范围。
17、上述应用或方法可为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法可不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
18、本专利技术所设计的部分互补双链双淬灭寡核苷酸核酸探针中的荧光基团和淬灭基团的距离比taqman探针的更近，使用双淬灭方式，淬灭更彻底，大大降低了荧光本底。另外，双探针可释放出更多荧光基团，信号更强，该技术提高了检测灵敏度。本专利技术的猴痘检测方法具有高灵敏、高特异性，灵敏度可达50拷贝/ml，可有效降低猴痘病毒低载量样本的漏检。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.用于检测猴痘病毒的引物对，其特征在于，所述引物对由MPXV-F和MPXV-R组成，所述MPXV-F为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子，所述MPXV-R为核苷酸序列是SEQ IDNo.2的单链DNA分子。
2.用于检测猴痘病毒的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括MPXV正义链探针MPXV-P1、MPXV反义链探针MPXV-P2、权利要求1中所述MPXV-F和MPXV-R，所述MPXV-P1为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA分子，所述MPXV-P2为核苷酸序列是SEQ IDNo.4的单链DNA分子。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述MPXV正义链探针MPXV-P1和MPXV反义链探针MPXV-P2的5’端标记荧光基团，3’端修饰有MGB。
4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中，所述MPXV-F、MPXV-R、MPXV正义链探针MPXV-P1和MPXV反义链探针MPXV-P2的摩尔比为2:2:1:1。
5.用于检测猴痘病毒的
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
7.检测猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2-4任一所述引物探针组合物对待测样品进行PCR扩增反应，根据扩增结果确定待测样品是否含有猴痘病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应中的所述MPXV-F、MPXV-R、MPXV正义链探针MPXV-P1和MPXV反义链探针MPXV-P2的摩尔比为2:2:1:1，所述PCR扩增反应的退火温度为55℃。
9.权利要求1所述的引物对在检测猴痘病毒或制备检测猴痘病毒的产品中的应用。
10.权利要求2所述的引物探针组合物在检测猴痘病毒或制备检测猴痘病毒的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于检测猴痘病毒的引物对，其特征在于，所述引物对由mpxv-f和mpxv-r组成，所述mpxv-f为核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子，所述mpxv-r为核苷酸序列是seq idno.2的单链dna分子。
2.用于检测猴痘病毒的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括mpxv正义链探针mpxv-p1、mpxv反义链探针mpxv-p2、权利要求1中所述mpxv-f和mpxv-r，所述mpxv-p1为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna分子，所述mpxv-p2为核苷酸序列是seq idno.4的单链dna分子。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpxv-p2的5’端标记荧光基团，3’端修饰有mgb。
4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正义链探针mpxv-p1和mpxv反义链探针mpx...
【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，荣振，韩勇军，王运祥，刘丽艳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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