【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种普鲁兰酶突变酶、其编码基因、表达菌株及其应用。
技术介绍
1、普鲁兰酶(pullulanase，ec3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶，能够专一的切割普鲁兰多糖、支链淀粉和葡聚糖中的α-1,6-糖苷键。大部分植物来源的淀粉都含有80％左右的支链淀粉，而大多数淀粉酶只能特异性水解α-1,4-糖苷键，对于分支点处的α-1,6-糖苷键没有水解活性。普鲁兰酶能够水解分子量较小的支链淀粉和部分极限糊精，通常在淀粉完全水解方面起着关键作用。随着生产技术的发展和不断优化，普鲁兰酶在淀粉制糖工业、抗性淀粉的生产、酒精发酵和洗涤剂行业都得到了广泛的应用，其工业应用潜力较大。
2、据报道，大多数普鲁兰酶适用于较高温度的淀粉加工过程。开发冷淀粉去支化，在中低温条件下对淀粉进行去支化，能够节约成本、降低能耗。因此，获得具有良好催化性能的淀粉冷水解适用普鲁兰酶，将有助于开发淀粉冷水解工艺。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术的不足，提供了一种普鲁兰酶突变酶、其编码基因、表达菌株及其应用。本专利技术以来自海洋未培养微生物来源的普鲁兰酶pulbs为基础，通过funclib设计突变位点后全基因合成，获得突变基因。含有突变质粒的工程菌诱导表达后，获得比酶活提高且稳定性提升的普鲁兰酶突变酶。以普鲁兰糖为底物时，突变酶的比酶活提高了1.42倍。在比活力提高的同时，突变体的稳定性也得到了提升。在30℃、ph7.5条件下，突变酶的稳定性较出发酶pulbs提升了23.5％
2、本专利技术普鲁兰酶突变酶，其氨基酸序列如seq id no：1所示，是由出发酶的氨基酸序列中第376位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第466位的谷氨酰胺突变为组氨酸，第528位的半胱氨酸突变为丝氨酸，且第584位的甘氨酸突变为丝氨酸。本专利技术普鲁兰酶突变酶，其氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。
3、所述普鲁兰酶突变酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
4、本专利技术突变质粒，为含有如seq id no：2所述的普鲁兰酶突变酶的编码基因。
5、本专利技术表达普鲁兰酶突变酶的菌株，含有所述突变质粒。
6、本专利技术表达普鲁兰酶突变酶的工程菌株，其分类命名为escherichia coli bl21(de3)/pet-28a(+)-pulbs-20，已送至中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：m 20232095，保藏时间为2023年11月01日，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。
7、本专利技术表达普鲁兰酶突变酶的工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
8、首先以来自厌氧芽孢杆菌属的普鲁兰酶的晶体结构为模板，利用swiss-model对普鲁兰酶pulbs的结构进行同源建模。采用半理性设计策略，选择催化活性中心附近非完全保守的氨基酸残基作为候选位点，通过funclib位点特异性分析及自由能计算获得自由能排名前50的突变设计，将其均采用autodockvina进行分子对接，选择与底物含α-1,6糖苷键的五糖亲和力较高的突变设计以确定突变的目标氨基酸，全基因合成并连入表达载体pet-28a(+)，表达宿主为e.coli bl21(de3)，得到含有本专利技术突变基因的工程菌株。
9、上述构建方法中所述表达质粒载体包括pcold、pet15、pet22等系列表达载体。
10、上述构建方法中所述宿主菌包括e.coli bl21(de3)、e.coli dh5α、e.coli jm109或e.coli rosetta等。
11、本专利技术普鲁兰酶突变酶可由所述工程菌株发酵获得。
12、本专利技术普鲁兰酶突变酶的应用，是将所述普鲁兰酶突变酶应用于辅助生淀粉水解酶水解生淀粉。30％质量浓度的淀粉乳，生淀粉水解酶0.17mg，普鲁兰酶突变酶的最优添加量为6mg，普鲁兰突变酶和生淀粉水解酶之间的添加比例约为35:1，水解体系的ph控制为5.5-7.0，温度控制为25℃-50℃。
13、以普鲁兰糖为底物时，在45℃、ph6.5条件下，突变酶的比酶活提高了1.42倍。在比活力提高的同时，突变酶的稳定性也得到了提升。在30℃、ph7.5条件下，突变酶的稳定性较出发酶提升了23.5％。与生淀粉水解酶共同作用水解生淀粉较单独使用生淀粉水解酶的水解率提升了6.9％，在淀粉冷水解方面具有很好的应用前景。
14、本专利技术对突变酶蛋白和原始野生型蛋白的比酶活、最适ph、最适温度、稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示，以普鲁兰糖为底物时，本专利技术获得的突变酶的比酶活相对出发酶提高了1.42倍。在比活力提高的同时，突变酶的稳定性也得到了提升，突变酶的半衰期相对出发酶延长了23.5％。与出发酶相比，突变酶的最适温度与最适ph相似，但比酶活和稳定性有了明显的提升。
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1.一种普鲁兰酶突变酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述普鲁兰酶突变酶的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
3.表达权利要求1所述普鲁兰酶突变酶的工程菌株，其特征在于：
4.权利要求1所述普鲁兰酶突变酶的应用，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种普鲁兰酶突变酶，其特征在于其氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.权利要求1所述普鲁兰酶突变酶的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如seq idno：2所示。
3.表达权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：房伟，王欣，张彧，张学成，肖亚中，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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