【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及利用环形grna/crispr系统进行线粒体基因组编辑的方法。
技术介绍
1、目前已知，线粒体dna(mtdna)的点突变和大规模的线粒体异质化会引起超过100种线粒体相关的疾病，包括：母系遗传leigh综合征、线粒体肌病、心肌病、leer遗传性视神经病等。并且mtdna上的碱基突变与某些关键疾病有关，例如糖尿病，阿尔茨海默氏病和癌症等。因此，通过基因编辑的方法，消除突变mtdna或者直接将点突变的mtdna进行碱基编辑，是线粒体疾病治疗的研究重点。
2、crispr/cas9系统是新一代基因编辑工具，具有简单、价格低廉、扩展性强、易于编程且非常高效的优点，是目前基因治疗领域最有前景的工具。并且基于crispr/cas9系统开发的碱基编辑(base editing,be)，无需产生dna双链断裂，也无需供体dna的参与，可实现靶位点的精准点突变，在单核苷酸遗传疾病治疗上具有重大应用前景。基于crispr/cas9的基因编辑系统，需要cas9蛋白和grna。因此，cas9和grna共同跨越双层膜结构，导入到线粒体内，是线粒体crispr/cas9的基因编辑系统发挥作用的前提。在cas9蛋白上添加了线粒体定位序列可以成功导入线粒体中，而grna导入到哺乳动物线粒体仍然存在巨大的困难，因此严重限制了crispr/cas9系统在线粒体基因组编辑中的应用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供利用环形grna/crispr系统进行线粒体基因组编辑的
2、第一方面，本专利技术要求保护一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品a。
3、本专利技术要求保护的用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品a，可包含如下任一项：
4、(a1)环形grna，和带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白；
5、(a2)表达构建体a1，和带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白；所述表达构建体a1包含编码环形grna的核苷酸序列；
6、(a3)环形grna，和表达构建体a2；所述表达构建体a2包含编码带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白的核苷酸序列；
7、(a4)所述表达构建体a1，和所述表达构建体a2；
8、(a5)表达构建体a3；所述表达构建体a3包含编码环形grna的核苷酸序列和编码带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白的核苷酸序列。
9、所述环形grna能够将所述带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白靶向线粒体基因组中的靶序列，所述带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白发挥其切割活性，从而实现对线粒体基因组的基因编辑。
10、如本专利技术所用，术语“crispr效应蛋白”通常指在天然存在的crispr系统中存在的核酸酶，或其修饰形式、其变体、其催化活性片段等。该术语涵盖基于crispr系统的能够在细胞内实现基因靶向(例如基因编辑、基因靶向调控等)的任何效应蛋白。如cas蛋白或其变体，进一步如cas9核酸酶或其变体。cas9是crispr/cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在sgrna的指导下靶向并切割dna靶序列形成dna双链断裂(dsb)。所述cas9核酸酶可以是来自不同物种的cas9核酸酶。
11、如本专利技术所用，术语“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在宿主细胞中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
12、本专利技术的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒等。
13、第二方面，本专利技术要求保护一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品b。
14、本专利技术要求保护的用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品b，可包含如下任一项：
15、(b1)环形grna，和带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白；
16、(b2)表达构建体b1，和带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白；所述表达构建体b1包含编码环形grna的核苷酸序列；
17、(b3)环形grna，和表达构建体b2；所述表达构建体b2包含编码带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列；
18、(b4)所述表达构建体b1，和所述表达构建体b2；
19、(b5)表达构建体b3；所述表达构建体b3包含编码环形grna的核苷酸序列和编码带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列；
20、所述碱基编辑融合蛋白中含有核酸酶失活的crispr效应蛋白和脱氨酶。
21、所述环形grna能够将所述带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白靶向线粒体基因组中的靶序列，从而所述带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白完成将所述靶序列中的一个或多个碱基进行定点替换。
22、进一步地，所述脱氨酶可为胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶。
23、当所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白可以实现将所述靶序列中的一个或多个c替换t。当所述脱氨酶为腺苷脱氨酶时，所述带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白可以实现将所述靶序列中的一个或多个a替换g。
24、在本专利技术的具体实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶为apobec；所述腺苷脱氨酶为tada。
25、在上述第一方面和第二方面中，所述环形grna为无3’末端和5’末端的环形grna。
26、进一步地，所述环形grna是使用i组内含子机制创建的，可通过如下方式获得的：将两端分别带有3’内含子和5’内含子的grna编码序列的表达盒导入细胞，在细胞中的鸟苷辅助因子催化的反应中，转录表达出的mrna中的两个内含子(intron)序列将grna序列的两端直接进行剪切连接反应而发生环化。
27、在本专利技术的具体实施方式中，上述第一方面中所述crispr效应蛋白为spcas9或sprycas9。
28、在上述第一方面中，在所述带有线粒体定位信号的crispr效应蛋白中，所述线粒体定位信号位于所述crispr效应蛋白的n端或c端。在本专利技术的具体实施方式中，所述线粒体定位信号位于所述crispr效应蛋白的n端。
29、在本专利技术的具体实施方式中，上述第二方面中所述核酸酶失活的crispr效应蛋白为ncas9，如cas9(d10a)。
30、在上述第二方面中，在所述碱基编辑融合蛋白中，所述脱氨酶融合至所述核酸酶失活的crispr效应蛋白的n端或c端。在本专利技术的具体实施方式中，所述脱氨酶融合至所述核酸酶失活的crispr效应蛋白的n端。
31、在上述第二方面中，在所述带有线粒体定位信号的碱基编辑融合蛋白中，所述线粒体定位信号位于所述碱基编辑融合蛋白的n端或c端。在本专利技术的具体实施方式中，所述线粒体定位信号位于所述碱基编辑融本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品，包含如下任一项：
2.一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品，包含如下任一项：
3.根据权利要求2所述的成套产品，其特征在于：所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶；
4.根据权利要求1-3中任一所述的成套产品，其特征在于：所述环形gRNA为无3’末端和5’末端的环形gRNA；
5.根据权利要求1所述的成套产品，其特征在于：所述CRISPR效应蛋白为spCas9或SPRYCas9；和/或
6.根据权利要求2所述的成套产品，其特征在于：所述核酸酶失活的CRISPR效应蛋白为nCas9；和/或
7.根据权利要求1-6中任一所述成套产品，其特征在于：在所述表达构建体A1和所述表达构建体B1中，启动编码环形gRNA的核苷酸序列转录的启动子为CMV启动子；和/或
8.权利要求1-7中任一所述的成套产品在对线粒体基因组进行基因编辑中的应用。
9.一种对线粒体基因组进行基因编辑的方法，包括如下步骤：向受体细胞中导入权利要求1-7中任一所述的成套
10.环形gRNA在对线粒体基因组进行CRISPR基因编辑中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品，包含如下任一项：
2.一种用于对线粒体基因组进行基因编辑的成套产品，包含如下任一项：
3.根据权利要求2所述的成套产品，其特征在于：所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶；
4.根据权利要求1-3中任一所述的成套产品，其特征在于：所述环形grna为无3’末端和5’末端的环形grna；
5.根据权利要求1所述的成套产品，其特征在于：所述crispr效应蛋白为spcas9或sprycas9；和/或
6.根据权利要求2所述的成套产品，其特征在于：所述核酸酶失...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，毕昌昊，陈荣浩，刘丽，曹宇，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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