【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药技术，具体涉及一种特异性抑制lamtor5基因表达的sirna、shrna和重组表达载体及其应用。
技术介绍
1、近年来，冠状病毒在全世界各地广泛传播病毒感染人数众多，死亡率高，严重危害人类健康。如2003年爆发的严重呼吸道疾病(sars-cov)致全世界约8000人感染。2014年，中东呼吸综合征(mers)在全世界多个国家暴发。2019年以来，新型冠状病毒(sars-cov-2)在全球各国全面爆发。冠状病毒的反复肆虐，急需开发预防和治疗药物。
2、由新型冠状病毒sars-cov-2引起的疾病被称为covid-19。sars-cov-2主要通过接触途径和气溶胶途径传播。sars-cov-2病毒入侵人体后，其表面的刺突糖蛋白(spike)与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2(ace2)结合，同时宿主细胞膜上的分子跨膜丝氨酸蛋白酶(tmprss2)切割spike蛋白，暴露病毒膜与宿主膜进行融合，帮助病毒进入宿主细胞中。进入细胞的sars-cov-2病毒内化后释放出遗传物质rna，进而利用宿主细胞细胞器等元件进行复制和翻译，组装形成大量的子代病毒；子代病毒随后通过胞吐等途径出胞，开始新一轮感染。目前研究认为，在包膜病毒感染进入到细胞内的过程中，细胞脂质在其中发挥了重要作用，某些抗病毒药物就是以此作为靶点发挥作用的。例如，应用他汀类药物抑制胆固醇的生物合成、应用酯化胆固醇干扰胆固醇代谢的方法在抗乙型肝炎病毒(hbv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、登革热病毒(denv)、巨细胞病毒(cmv)等的病毒感
3、lamtor5(late endosomal/lysosomal adaptor，mapk and mtor activator 5)是一类高度保守的组成型蛋白，在成人组织中广泛表达，是ragulator蛋白复合体的重要成分。因其能与乙型肝炎病毒编码的蛋白hbx的c末端发生特异性结合，又称为lamtor5。lamtor5作为一种新发现的关键癌蛋白，其过表达能够促进癌细胞的增殖、迁移或异常糖代谢、脂代谢，与许多癌症的预后不良有关。研究显示，lamtor5能够影响胆固醇的代谢，而胆固醇代谢又在病毒感染中发挥了重要作用，提示其可能是影响病毒感染的重要靶点。细胞膜上可用胆固醇(accessible cholesterol)决定着细胞膜的流动性及膜融合，细胞膜融合进一步促进合胞体(syncytia)形成，从而为包膜病毒感染和扩散创造条件。胆固醇-25-羟化酶(ch25h)通过催化25-羟基胆固醇(25-hc)而促进膜上胆固醇进入胞内，由此阻断膜融合和病毒感染。尽管ch25h和25-hc已被认为是抗病毒治疗中潜在靶标，但相关药物的研发仍处于初级阶段。
4、与传统抗病毒药物相比，新型sirna药物在抗呼吸道病毒应用上优势显著，它具有可设计性强、特异性强、反应快速等特点。目前已有多种基于rnai的药物获得美国食品药品监督管理局(fda)批准或进入临床试验，且rna类药物获批数量逐年增加，充分证明rna疗法的巨大潜力。在sirna新型冠状病毒药物方面，我国自主研发的抗冠状病毒新药、全球首个全修饰吸入小核酸新药sns812已获美国fda批准进入临床，并完成首次人体给药。它有机会对抗新型冠状病毒的快速进化和流感化影响，成为对抗新型冠状病毒基因突变的最佳治疗方法之一。这表明sirna治疗新冠病毒等呼吸道病毒感染有着广阔的市场和应用潜力。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中，在有效预防和治疗流感和新冠病毒的感染时，当前相关药物靶点空缺的局限，提供一种特异性抑制lamtor5基因表达的sirna、shrna，以及含有上述sirna或shrna的重组表达载体、细胞，并且进一步提供预防和/或治疗新冠病毒、流感病毒感染药物、抗病毒药物中的应用。
2、本专利技术整体思路为：本专利技术前期首次发现了一个直接作用于ch25h并引起其自噬降解的蛋白分子lamtor5。因此本专利技术通过设计lamtor5靶向的特异性sirna或shrna，获得了可调节ch25h并抑制合胞体形成的核酸小分子。体内外实验证明，该核酸小分子可明显阻止细胞膜融合而形成多核巨细胞，从而抑制新冠病毒、流感病毒的感染；通过滴鼻方式给予小鼠lamtor5 sirna治疗，可显著抑制小鼠对新冠病毒、流感病毒的感染。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
4、一种特异性抑制lamtor5基因表达的sirna，所述的sirna，其正义链核苷酸序列如seq id no.1所示，反义链核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、seq id no.1：5’-ggaacauuaugauccagaa-3’
6、seq id no.2：5’-uucuggaucauaauguucc-3’
7、一种特异性抑制lamtor5基因表达的shrna，所述的shrna，其是针对lamtor5基因的短发夹rna，与上述sirna对应的shrna。其中，所述的shrna，其正义链核苷酸序列如seqid no.3所示，反义链核苷酸序列如seq id no.4所示。
8、seq id no.3：
9、5’-cauacaaaucuuagucuauuagcuuuaauagacuaagaucugugug-3’
10、seq id no.4：
11、5’-cacacagaucuuagucuauuaaagcuaauagacuaagauuuguaug-3’
12、注：根据wipost.26标准规定，使用“t”表示dna中的胸腺嘧啶和rna中的尿嘧啶，因此在制作的xml格式的wipo序列表中，将上述sirna和shrna中的“u”替换成了“t”。
13、一种能产生上述sirna或上述shrna的dna分子也在本专利技术所保护的范围之内。
14、一种含有上述编码sirna基因序列或含有上述编码shrna基因序列的重组表达载体也在本专利技术所保护的范围之内。
15、具体的，上述编码sirna/shrna基因序列的合成、含有上述编码sirna/shrna基因序列的重组质粒的构建均由上海捷瑞公司完成。
16、一种含有上述编码sirna基因序列或上述编码shrna基因序列的lamtor5敲减细胞也在本专利技术所保护的范围之内。
17、具体的，构建含有上述编码sirna基因序列或上述编码shrna基因序列的lamtor5敲减细胞，包括以下步骤：(1)准备2个1.5ml的ep管标记为①和②，在①号管中加入2μglamtor5 sirna和100μl的无血清的dmem培养基并混匀，在②管中加入2μg lamtor5 shrna和100μl的无血清的dmem培养基并混匀；(2)准备2个1.5ml的ep管标记为③和④，在③号管中加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性抑制Lamtor5基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA，其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种特异性抑制Lamtor5基因表达的shRNA，其特征在于，所述的shRNA，其是针对Lamtor5基因的短发夹RNA，与权利要求1所述的siRNA对应的shRNA。
3.根据权利要求2所述的shRNA，其特征在于，所述的shRNA，其正义链核苷酸序列如SEQID NO.3所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种能产生权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述的shRNA的DNA分子。
5.一种含有权利要求1所述的编码siRNA基因序列或含有权利要求3所述的编码shRNA基因序列的重组表达载体。
6.一种含有权利要求1所述的编码siRNA基因序列或含有权利要求3所述的编码shRNA基因序列的Lamtor5敲减细胞。
7.权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述的shRNA或权利要求4所述的DNA分子或权
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的新冠病毒为：非突变型的新冠病毒；所述的流感病毒为：H1N1流感病毒。
9.一种用于预防和/或治疗新冠病毒、流感病毒感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述的shRNA，或者还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
10.权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述的shRNA或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6所述的Lamtor5敲减细胞在制备抗病毒药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物能够靶向降低Lamtor5表达，增加CH25H作用，减少细胞膜上的胆固醇。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性抑制lamtor5基因表达的sirna，其特征在于，所述的sirna，其正义链核苷酸序列如seq id no.1所示，反义链核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.一种特异性抑制lamtor5基因表达的shrna，其特征在于，所述的shrna，其是针对lamtor5基因的短发夹rna，与权利要求1所述的sirna对应的shrna。
3.根据权利要求2所述的shrna，其特征在于，所述的shrna，其正义链核苷酸序列如seqid no.3所示，反义链核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.一种能产生权利要求1所述的sirna或权利要求2所述的shrna的dna分子。
5.一种含有权利要求1所述的编码sirna基因序列或含有权利要求3所述的编码shrna基因序列的重组表达载体。
6.一种含有权利要求1所述的编码sirna基因序列或含有权利要求3所述的编码shrna基因序列的lamtor5敲减细胞...
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