【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检验，具体涉及多氏拟杆菌菌种特异性分子靶标及其快速检测方法。
技术介绍
1、拟杆菌是一类杆状、不产生孢子、耐受胆汁、革兰氏阴性的严格厌氧菌，其无氧呼吸的主要副产物是乙酸、异戊酸和琥珀酸。作为人类肠道重要的基石菌属，拟杆菌约占人类肠道微生物总数的25％，其可与人类建立稳定的共生关系，能利用碳水化合物发酵产生有益于人类健康的短链脂肪酸，有助于调节肠道微环境、维持肠道的生理功能。拟杆菌参与人体结肠中许多重要的代谢活动，除发酵碳水化合物外，还可利用含氮物质，以及完成胆汁酸和其他类固醇的生物转化。拟杆菌与人类健康密切相关，在人类免疫系统调节、骨矿物质密度的增加、抑制性神经递质γ-氨基丁酸的产生中发挥重要作用，其减少与冠状动脉疾病、炎症性肠病等多种疾病相关。值得注意的是，部分拟杆菌可能携带毒素编码基因，产生毒素，引起宿主产生腹泻等症状；此外，当拟杆菌抵达肠道以外的身体部位时，可能会导致中枢神经系统、皮肤和软组织等部位的感染。多氏拟杆菌(bacteroides dorei)最初由bakir等从人类粪便中分离出来，后被报道能有效地将胆固醇转化为粪甾醇，进而预防高脂饮食引起的心血管疾病。研究显示，冠状动脉疾病患者中多氏拟杆菌的丰度显著降低；此外，多氏拟杆菌被证实可通过促进早期干扰素表达以及下调局部和全身炎症反应发挥抗流感作用，可见多氏拟杆菌对人类健康的益处值得关注。近年来，益生菌研究领域空前发展，双歧杆菌、乳酸菌等第一代益生菌已广泛应用于人类疾病的预防及辅助治疗。以脆弱拟杆菌、多氏拟杆菌等对人类健康有益的菌种为代表的拟杆菌，凭
2、目前拟杆菌的检测主要有：基于分离培养后的形态学检测、生化试验、或质谱技术检测等。此类方法需首先对样品进行厌氧条件下的富集与选择性培养，获得单菌落后再进行显微镜观察、生化鉴定或上机检测，实验操作繁琐、耗时长、成本高，且不能进行定量分析。近年来分子生物学快速发展，基于核酸扩增的检测方法相继建立，此类方法在检测时间、特异性及灵敏度方面均具有显著优势。以pcr为主的分子生物学检测方法逐步取代传统培养及生化检测方法，成为微生物检测中最具潜力的新型技术之一。核酸检测方法的关键在于靶基因或靶序列的选择，即寻找目标物种特有的核苷酸序列进行检测设计。得益于微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，获得特异性分子检测靶标，可开发简单、快速、经济、高效、高灵敏度的pcr鉴定技术。
技术实现思路
1、为了克服现有技术存在的上述不足，本专利技术旨在提供用于检测及鉴别多氏拟杆菌的种特异性分子靶标及其相应的检测方法，能将多氏拟杆菌从拟杆菌属及其他微生物中区分出来。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
3、一种用于检测多氏拟杆菌的特异性检测分子靶标，所述的多氏拟杆菌分子靶标具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
4、本专利技术还提供一组用于检测多氏拟杆菌特异性分子靶标的引物，所述的引物包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。
5、本专利技术还提供一种检测多氏拟杆菌的试剂盒，其包含上述用于检测多氏拟杆菌特异性分子靶标的引物。
6、本专利技术还提供上述的多氏拟杆菌特异性分子靶标、用于检测多氏拟杆菌的引物或试剂盒在检测多氏拟杆菌中的应用。
7、本专利技术还提供一种非疾病诊断和治疗目的的检测多氏拟杆菌的方法，包括以下步骤：
8、提取待测样品微生物的dna，采用上述用于检测多氏拟杆菌的引物对其进行pcr扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，如获得大小为193bp的条带，则判定样品中检出多氏拟杆菌，若未获得193bp的条带则判定样品中未检出多氏拟杆菌。
9、优选的，所述的pcr扩增体系为25μl，其中包括：2×dream taq green pcr mastermix12.5μl，10μmol/l正向引物及反向引物各0.5μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水10.5μl。
10、优选的，所述的pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸30s，共进行34个循环；72℃延伸5min。
11、本专利技术还提供一种非疾病诊断和治疗目的对多氏拟杆菌进行定量的qpcr检测方法，包括以下步骤：
12、(1)应用上述用于检测多氏拟杆菌的引物绘制标准曲线；
13、(2)应用上述用于检测多氏拟杆菌的引物对样本进行qpcr扩增，获得样本的ct值，根据标准曲线计算该样品中多氏拟杆菌的含量。
14、优选的，所述的qpcr扩增体系为20μl，其中包括：2×tb green premix ex taqⅱ10μl，10μmol/l正向引物及反向引物各0.2μl，灭菌双蒸水7.6μl，待测dna溶液2μl。
15、优选的，所述的qpcr反应程序为两步法pcr反应程序：95℃预热30s；95℃变性5s、68℃退火30s，共进行45个循环。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：
17、(1)本专利技术基于多氏拟杆菌的全基因组测序信息，通过泛基因组分析挖掘出多氏拟杆菌菌种特异性分子靶标，并采用pcr扩增技术进行验证，结果准确可靠。
18、(2)本专利技术提供的多氏拟杆菌检测方法无需经过微生物培养等步骤，具有操作简单、经济快速、高效灵敏的特点，可适用于多种复杂样品。
19、(3)本专利技术提供的多氏拟杆菌检测方法既可定性、又可定量，应用范围广。
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1.一种用于检测多氏拟杆菌的特异性检测分子靶标，其特征在于，所述的多氏拟杆菌分子靶标具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一组用于检测权利要求1所述的分子靶标的引物，其特征在于，所述的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物。
3.一种检测多氏拟杆菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物。
4.权利要求1所述的分子靶标、权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在检测多氏拟杆菌中的应用。
5.一种非疾病诊断和治疗目的的检测多氏拟杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为25μL，其中包括：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L正向引物及反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水10.5μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；
8
9.根据权利要求8所述的qPCR检测方法，其特征在于，所述的qPCR扩增体系为20μL，其中包括：2×TB Green Premix EX TaqⅡ10μL，10μmol/L正向引物及反向引物各0.2μL，灭菌双蒸水7.6μL，待测DNA溶液2μL。
10.根据权利要求8所述的qPCR检测方法，其特征在于，所述的qPCR反应程序为两步法PCR反应程序：95℃预热30s；95℃变性5s、68℃退火30s，共进行45个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测多氏拟杆菌的特异性检测分子靶标，其特征在于，所述的多氏拟杆菌分子靶标具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
2.一组用于检测权利要求1所述的分子靶标的引物，其特征在于，所述的引物包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。
3.一种检测多氏拟杆菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物。
4.权利要求1所述的分子靶标、权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在检测多氏拟杆菌中的应用。
5.一种非疾病诊断和治疗目的的检测多氏拟杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增体系为25μl，其中包括：2×dream taq green pcr master mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱振军，丁郁，谢芷晴，张芬，黄奥环，谢纪航，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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