【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蜕皮激素类似物及拮抗物的，更具体地说是涉及一种便于筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的重组载体及其构建方法与应用。
技术介绍
1、昆虫生长发育过程受蜕皮激素的严格调控，蜕皮激素的主要作用是调控昆虫的周期性蜕皮，从而决定虫体大小和形态的变化。在幼虫发育时期，蜕皮激素的分泌活性随龄期呈现周期性变化，从而导致血淋巴中蜕皮激素滴度的不断改变。蜕皮激素又称蜕皮甾醇，是昆虫体内第一个化学结构得到鉴定的激素。随后，蜕皮激素及其相关的类似物不仅在昆虫体内有发现，在其他甲壳动物、棘皮动物、软体动物和环节动物中都有发现，此外在多种植物中也分离得到许多具有蜕皮激素活性的甾类。
2、在全变态昆虫和半变态昆虫中，每次幼虫蜕皮时，蜕皮激素的滴度都快速升高，通常其滴度在表层溶离前达到高峰，此后新表皮不断形成，其滴度不断降低，至蜕皮时滴度下降到最低值。因此，利用蜕皮激素类似物或抗蜕皮激素干扰昆虫生长和蜕皮，可以达到害虫防治的目的。第三代杀虫剂即昆虫生长调节剂正是基于昆虫激素对昆虫生长发育的调控而开发设计的。通过干扰、抑制昆虫的正常生长发育，抑制蜕皮变态、抑制繁殖等生理过程而实现的。该类杀虫剂具有活性高、专一性强，低毒，低残留等特点，是当代开发非杀性药剂的重要研究对象。
3、非甾醇双酰肼类杀虫剂是近年来开发的新型、高效、具有蜕皮激素活性的昆虫生长调节剂。然而随着该类杀虫剂的使用时间和范围扩大，害虫产生抗性的几率也越来越大。因此，减少单一类杀虫剂的使用，开发多种杀虫剂联合循环使用迫在眉睫。现有筛选蜕皮激素类似物或拮抗剂的方法主要是通过
4、因此，迫切需要一种便于筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的方法，以便能够更便捷、高效、大规模筛选蜕皮激素类似物及拮抗物。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种便于筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的重组载体及其构建方法与应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
2、一种筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的重组载体，重组载体为pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror载体，核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、所述的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
4、s1：构建pgl3-ecre-fluc载体；
5、s2：构建pac-rluc-puror载体；
6、s3：构建pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror载体。
7、进一步地，所述s1的具体操作为：在载体pgl3 basic质粒sacⅰ和xhoⅰ处插入插入4×ecre及hsp70 minimal promoter，获得pgl3-ecre-fluc载体；
8、所述ecre核苷酸序列如seq id no.2所示；hsp70 minimalpromoter核苷酸序列如seq id no.3所示；pgl3-ecre-fluc载体核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、进一步地，s2的具体操作方法为：
10、1)以prl-sv40质粒为模版，利用正向引物rluc-s、反向引物rluc-as克隆获得海肾荧光素酶编码基因rluc，去掉rluc的终止密码子；
11、2)利用takara胶回收试剂盒纯化回收pcr产物，纯化后的rluc片段以及pac-y1sgrna-cas9质粒利用限制性内切酶hindiii和kpni于37℃酶切3h后，割胶回收目的片段及载体；
12、3)利用t4 dna连接酶于16℃连接过夜后进行常规转化、测序，获得pac-rluc-puror载体。
13、进一步地，所述正向引物rluc-s核苷酸序列如seq id no.5所示；所述反向引物rluc-as核苷酸序列如seq id no.6所示；所述rluc核苷酸序列如seq id no.7所示；s2制备出的pac-rluc-puror载体核苷酸序列如seq idno.8所示。
14、进一步地，所述pcr体系包括如下成分：10×pcrbuffer 5μl，prl-sv40质粒4.3ng/μl 1μl，正向引物20μm 1μl，反向引物20μm 1μl，dntp 1μl，rtaq(takara)0.5μl，ddh2o40.5μl；
15、所述pcr反应条件为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
16、所述质粒酶切体系包括如下成分：1×mbuffer 3μl，质粒pac-y1sgrna-cas91μg/μl 16μl，hindiii 0.5μl，kpni 0.5μl，ddh2o 10μl；
17、所述rluc序列酶切体系包含如下成分：1×mbuffer 3μl，rluc 15μl，hindiii 0.5μl，kpni 0.5μl，ddh2o 11μl；
18、所述连接体系包含如下成分：10×buffermix 1μl，酶切质粒0.5μl，酶切片段6μl，t4 dna ligase 0.5μl，ddh2o 2μl。
19、进一步地，s3的具体操作方法为：
20、1)利用正向引物s和反向引物as，以pac-rluc-puror载体为模版，扩增包含actin5启动子、rluc以及puror和sv40序列的片段；
21、2)利用takara胶回收试剂盒纯化回收pcr产物；使用bamhⅰ和salⅰ限制性内切酶将pgl3-ecre-fluc 9载体线性化后，利用gibson assembly kit无缝克隆试剂盒将回收的pcr片段和线性化的载体连接；
22、3)将反应体系置于50℃水浴锅，15min后进行常规转化、测序，获得蜕皮激素类似物或拮抗剂筛选载体，记为pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror
23、进一步地，所述正向引物s的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述反向引物as的核苷酸序列如seq id no.10所示。
24、一种pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror稳转细胞系，由权利要求1中所述pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror重组载体转染至果蝇kc细胞系中得到。
25、所述重组载体或重组细胞系在高通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的重组载体，其特征在于，重组载体为pGL3-EcRE-Fluc-Ac5-Rluc/PuroR载体，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述S1的具体操作为：在载体pGL3 basic质粒SacⅠ和XhoⅠ处插入4×EcRE及hsp70 minimal promoter，获得pGL3-EcRE-Fluc载体；
4.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，S2的具体操作方法为：
5.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，
6.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于：
7.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，S3的具体操作方法为：
8.权利要求7所述的重组载体的制备方法，其特征在于，
9.一种pGL3-EcRE-Fluc-Ac5-Rluc/PuroR稳转细胞系，其特征在于，由权利要求1中所述pGL
10.权利要求1-9所述重组载体或重组细胞系在高通量筛选蜕皮激素类似物和/或拮抗物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种筛选蜕皮激素类似物及拮抗物的重组载体，其特征在于，重组载体为pgl3-ecre-fluc-ac5-rluc/puror载体，核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述s1的具体操作为：在载体pgl3 basic质粒sacⅰ和xhoⅰ处插入4×ecre及hsp70 minimal promoter，获得pgl3-ecre-fluc载体；
4.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，s2的具体操作方法为：
...
【专利技术属性】
技术研发人员：何倩毓，高新宇，高日晨，孙红毅，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。