【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种液-液相分离能力增强的p53变体及其杀伤肿瘤细胞的应用。
技术介绍
1、转录因子p53是细胞内最为重要的肿瘤抑制因子，它在50%以上的癌细胞中发生突变失去活性，在其余的癌细胞中p53的活性或下游信号通路被抑制。p53作为“基因组保镖”通过响应细胞内外应激条件，进而转录激活其下游靶基因 cdkn1a、 puma、bax等诱导dna损伤修复、细胞周期停滞或细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。所以在癌细胞中恢复/提高p53活性是目前抑制癌细胞增殖的一种策略。
2、在癌细胞中恢复/提高p53活性的方法包括：1）抑制野生型p53降解；2）抑制突变型p53蛋白活性；3）转入p53 cdna 的基因疗法。其中唯一一种已经获得临床批准的疗法是基因疗法。一项利用重组缺陷型腺病毒递送野生型p53用于治疗头颈癌的基因疗法（gendicine）已经在中国得到临床批准。其它递送野生型p53的基因疗法如onyx-015仍在临床实验中。p53基因疗法联合免疫检查点抑制剂（pd-1/pd-l1抗体）治疗实体瘤的方法已进入临床二期实验。虽然基因疗法直接递送野生型p53被证明是能够杀死癌细胞的，但是由于野生型p53的不稳定性以及癌细胞中已经存在的具有获得性功能（gain-of-function）的突变体p53会导致野生型p53不能够有效地发挥功能，从而使得治疗效果有限。因此，亟需开发具有更强肿瘤抑制效果的p53变体来提高p53基因疗法的有效
技术实现思路
1、针对上述现存的问题，本专利技术的目的是提供具有更强液-液相分离能力及活性的p53变体及其用途。
2、具有更强液-液相分离能力的p53变体，在p53序列的一端添加富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列，在细胞水平和体外比野生型p53具有更强的液-液相分离能力，具有更强的转录激活活性；所述的富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列的通式为hx(g/s/p/a/t)y(r/k)z，其中h：为组氨酸；(g/s/p/a/t)：为由甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸之一或多个组成的序列；（r/k）为精氨酸或赖氨酸，其中x，y，z 是相应氨基酸的个数， x，z=0-20，y=0-100， x+z>5。
3、所述的富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列与野生型p53序列的一端之间进一步具有间隔（linker）序列。
4、所述的p53具有转录激活活性，dna序列如seq id no.1、 seq id no.2所示。
5、所述的p53具有转录激活活性，包括人和非人的物种。
6、所述的p53变体dna序列如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq idno.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
7、所述的p53变体，能够激活 cdkn1a靶基因的转录，提高 cdkn1a、 mdm2、 puma、 noxa以及 rrm2b中的一个或者多个的下游靶基因的转录水平。
8、所述p53变体在制备肿瘤治疗药物中的用途，适用的肿瘤种类包括非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤以及人脑瘤；所述的药物包括核酸水平和蛋白水平起到活性作用的药物。
9、所述的p53变体的重组蛋白表达体系包括大肠杆菌表达宿主、动物细胞以及酵母蛋白表达系统；原核表达载体包括pet24a，pet28a(+)；真核生物表达载体包括：1）pegfp、peyfp、pmcherry、prfp、pecfp、plenti、plx、pcmv6、pcmv3、pcdna3以及pcdna6b动物细胞表达载体；2）昆虫细胞表达载体包括pac5.1-egfp等；3）酵母表达载体包括ppic3以及ppic9。
10、所述的p53变体的蛋白质形式包括全长形式，和保留功能的突变形式。
11、所述的p53变体介导肿瘤细胞凋亡的靶标分子包括 fgfr3，用于治疗 fgfr3表达量高的肿瘤。
12、所述的肿瘤治疗药物为p53变体与fgfr抑制剂tas-120以及wnt信号通路抑制剂iwr-1联合使用的药物，或者制备的复合药物，用于提高在较低蛋白浓度时增强其杀伤肿瘤细胞的能力。
13、所述的药物的形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、颗粒剂、软膏剂。
14、本专利技术具有的技术效果为：
15、（1）本申请创新性设计的llpse-p53（p53变体）在细胞内和细胞外的液-液相分离效果更强。
16、（2）本申请明确了液-液相分离能力更强的p53变体促进了p53靶基因 cdkn1a等的转录激活。
17、（3）本申请证明了llpse-p53对多种肿瘤细胞均有显著杀伤效果，说明其有很好的肿瘤治疗的临床应用潜力，创新性的从相分离角度揭示了p53抑制肿瘤细胞增殖的机理。
18、（4）本申请证明了低浓度llpse-p53蛋白与药物联合使用能够提高其肿瘤杀伤效果，为其应用于肿瘤临床治疗提供了新的思路和基础。
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1.具有更强液-液相分离能力的p53变体，其特征在于，在p53序列的一端添加富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列，在细胞水平和体外比野生型p53具有更强的液-液相分离能力，具有更强的转录激活活性；
2.根据权利要求1所述的p53变体，其特征在于，能够激活CDKN1A靶基因的转录，提高CDKN1A、MDM2、PUMA、NOXA以及RRM2B中的一个或者多个的下游靶基因的转录水平。
3.一种根据权利要求1所述p53变体在制备肿瘤治疗药物中的用途，其特征在于，适用的肿瘤种类包括非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤以及人脑瘤；
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的p53变体的重组蛋白表达体系包括大肠杆菌表达宿主、动物细胞以及酵母蛋白表达系统；原核表达载体包括pET24A，pET28A(+)；真核生物表达载体包括：1）pEGFP、pEYFP、pmcherry、pRFP、pECFP、pLenti、pLX、pCMV6、pCMV3、pcDNA3以及pcDNA6B动物细胞表达载体；2）昆虫细胞表达载体包括pAc5.1-EGFP；3）酵母表达载体包括p
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的p53变体介导肿瘤细胞凋亡的靶标分子包括FGFR3，用于治疗FGFR3表达量高的肿瘤。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤治疗药物为p53变体与FGFR抑制剂TAS-120以及Wnt信号通路抑制剂IWR-1联合使用的药物，或者制备的复合药物，用于提高在较低蛋白浓度时增强其杀伤肿瘤细胞的能力。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物的形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、颗粒剂、软膏剂。
...【技术特征摘要】
1.具有更强液-液相分离能力的p53变体，其特征在于，在p53序列的一端添加富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列，在细胞水平和体外比野生型p53具有更强的液-液相分离能力，具有更强的转录激活活性；
2.根据权利要求1所述的p53变体，其特征在于，能够激活cdkn1a靶基因的转录，提高cdkn1a、mdm2、puma、noxa以及rrm2b中的一个或者多个的下游靶基因的转录水平。
3.一种根据权利要求1所述p53变体在制备肿瘤治疗药物中的用途，其特征在于，适用的肿瘤种类包括非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤以及人脑瘤；
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的p53变体的重组蛋白表达体系包括大肠杆菌表达宿主、动物细胞以及酵母蛋白表达系统；原核表达载体包括pet24a，pet28a(+)；真核生物表达载体包括：1）...
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