【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水稻分子标记和育种领域，涉及基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因 pita、 pid2、 pi25/ pid3和 ptr的基因分型的引物组合及应用，能够有效地对水稻种质资源及杂交后代进行早期抗病基因型筛选，提高水稻抗病育种的效率。
技术介绍
1、稻瘟病是由稻瘟病菌（ magnaporthe grisea）引起的一种极具破坏性的水稻病害，全球每年因稻瘟病害可减产10%~30%。从环境保护与农业可持续发展考虑，利用寄主抗性，选育和种植稻瘟病抗性品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统抗性品种选育一般依靠表型鉴定，且需要加大群体规模和增加鉴定批次以减少环境和人为因素的影响，这极大地增加了抗性育种的工作量与成本。利用已克隆的稻瘟病抗性基因的连锁标记或功能基因标记，从分子水平跟踪目标基因，选择含有目标抗性基因的单株进行杂交或回交，不仅能精准指导抗病性状的定向改良，并且能减少杂交或回交群体的大小，节省成本。
2、随着dna分子标记的出现与迅猛发展，标记辅助选择（marker-assistedselection, mas）技术已成为正确选择抗病基因的有效途径。但由于抗病基因与分子标记间的重组率在不同的群体中有较大差异，同时构建分子标记的群体往往不是育种材料，在实际应用中有一定的局限性。现有技术中的分子标记大多不
3、分子标记辅助选择育种（molecular marker-assisted selection，mas）是一种利用分子标记对植物或动物个体进行遗传分析和筛选的育种策略。snp （single nucleotidepolymorphism）即单核苷酸多态性，是两个dna序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。snp标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，可以在早期（苗期）进行分子标记分析，快速鉴定个体的遗传特征抗病基因的基因型。通过，可以提供有关其遗传特征和表型性状的信息，从而帮助育种者选择具有期望性状的个体进行繁殖和育种。
4、kasp（kompetitive allele-specific pcr）是一种基于pcr的分子标记技术，用于检测基因组中的snp。kasp结合了特异性引物和特异性探针的设计，通过竞争性特性确定目标snp的等位基因。因kasp技术对检测样本纯度及浓度（1-10 ng dna即可加入反应）要求不高，且具有高准确度、灵活性及低成本的特性，是一种高效、准确、经济且具有可扩展性的分子标记技术。在遗传研究、种质资源评价、育种和基因组学研究等领域中发挥着重要的作用。例如，cn202111483095.3公开了一种快速鉴定苹果炭疽叶枯病的snp分子标记用于苹果杂交种鉴定的核心snp标记，基于其设计的引物组合，能够快速检测存在苹果中炭疽叶枯病的种质，从而有效对苹果杂种实生苗进行早期抗病筛选，提高苹果抗病育种的效率；cn201710297282.x公开了基于kasp技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用方法，利用所述水稻产量基因分型引物组合，以及提供的kasp检测方法，能够实现水稻种质中常量基因功能等位基因的情况，结果准确，从而达到快速高效低成本的检测。但现有技术中尚未发现采用kasp技术进行水稻稻瘟病分子标记辅助选择的研究。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本专利技术提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因 pi-ta、 pi-d2、 pi25/ pid3和 ptr的功能性分子标记及其应用。采用本专利技术所述的分子标记及鉴定方法可以对水稻种质资源和育种子代在苗期进行抗病基因型筛选，淘汰携带感病基因型子代植株，大大提高水稻抗病育种效率。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、本专利技术提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因 pi-ta、 pi-d2、 pi25/ pid3和 ptr的功能性分子标记，包括pi-ta分子标记、pi-d2分子标记、pi25/pid3分子标记和ptr分子标记；
4、所述 pi-ta分子标记位于水稻 pi-ta基因第2752位核苷酸，该位点为g时，为 pi-ta抗病等位基因，该位点为t时，为 pi-ta感病等位基因；
5、所述 pi-d2分子标记位于水稻 pi-d2基因第1323位核苷酸，该位点为a时，为 pi-d2抗病等位基因，该位点为t时，为 pi-d2感病等位基因；
6、所述 pi25/ pid3分子标记位于水稻 pi25/ pid3基因第2209位核苷酸，该位点为c时，为 pi25/ pid3抗病等位基因，该位点为t时，为 pi25/ pid3感病等位基因；
7、所述 ptr分子标记位于水稻 ptr基因第2606位和第2611位的核苷酸变异以及第2608位12个核苷酸的插入/缺失变异，2606位为t、2612位为g且2608位缺失12 bp序列时，为 ptr抗病等位基因；而2606位为a、2612为a且2608位插入12 bp序列时，为 ptr感病等位基因；所述12 bp序列为aaaccagaaaaa。
8、本专利技术还提供基于kasp技术用于水稻抗稻瘟病基因 pi-ta、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.水稻抗稻瘟病基因的功能性KASP分子标记，其特征在于，包括Pi-ta分子标记、Pi-d2分子标记、Pi25/Pid3分子标记和Ptr分子标记；
2.根据权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因的功能性KASP分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记用于KASP反应的引物序列如下：
3.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因功能性KASP分子标记或权利要求2所述的引物在水稻种质资源的筛选、鉴定或分子标记辅助育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在权利要求2所述引物中，按照上游分型引物 1：上游分型引物 2：下游通用引物=1:1:3 的比例形成混合引物，引物终浓度为10 μM。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用权利要求2所述的引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-d2、Pi25/Pid3和Ptr的基因型。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，DNA提取方法包括：取生长两周的水稻叶片100 mg，置于含有钢珠的2 mL离心管中，立即液氮冷冻5
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为5 μL，包括2.5 μL 2×KASP Master Mix、DNA模板1.25 μL、权利要求3所述的混合引物1.25 μL；并在每个96孔板上设置无模板对照。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，反应条件为：（1）95°C预变性10 min；（2）95°C变性20 s、55-61°C退火/延伸60 s，共10个循环；（3）95°C变性20 s、55°C退火/延伸60s，共27个循环。
9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR反应结束后，利用BIO-RAD CFX荧光定量PCR仪对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描结果导出列表格式，制作分型图。
...【技术特征摘要】
1.水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记，其特征在于，包括pi-ta分子标记、pi-d2分子标记、pi25/pid3分子标记和ptr分子标记；
2.根据权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记用于kasp反应的引物序列如下：
3.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因功能性kasp分子标记或权利要求2所述的引物在水稻种质资源的筛选、鉴定或分子标记辅助育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在权利要求2所述引物中，按照上游分型引物 1：上游分型引物 2：下游通用引物=1:1:3 的比例形成混合引物，引物终浓度为10 μm。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用权利要求2所述的引物对水稻基因组dna进行pcr扩增，根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病基因pi-ta、pi-d2、pi25/pid3和ptr的基因型。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，dna提取方法包括：取生长两周...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，邬淑婷，陶菊红，沈雪林，朱正斌，孙小芹，季向东，柯瑷，沈子杰，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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