【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种响应氮饥饿信号的启动子在定向调控基因转录用中的应用，属于微生物代谢工程和分子生物学研究领域。
技术介绍
1、启动子在合成生物学与代谢工程中是必不可少的调控元件，能够调控下游基因的表达时间与表达水平。目前常用的启动子主要有组成型启动子与诱导型启动子，在组成型启动子的调控下基因以恒定的水平表达，且不受外界环境信号的影响。组成型启动子能为目的基因提供一个稳定且强有力的转录水平，然而组成型启动子由于能够长期启动基因表达，有可能导致前体物的不平衡供应并对菌体造成代谢压力，降低目标产物的产率。诱导型启动子能够由特定条件抑制或激活，并且只有在被诱导时才开启下游基因表达。运用诱导型启动子能够人为地调控目的基因的转录，定时启动目的基因的表达，从而更灵活的针对不同的宿主细胞制定对其最优的调控策略，减少了基因表达的不适时启动导致的潜在代谢压力。自诱导启动子与诱导型启动子的不同在于，该启动子无需添加额外的诱导物质，而是被菌体生长所改变的培养条件激活。
2、在产油微生物中，由氮源耗尽所诱导的脂质积累现象普遍存在。高山被孢霉发酵过程可根据营养水平的变化分为两个阶段：
3、氮源耗尽前的菌体生长期和氮源耗尽后的脂质积累期，氮耗尽是诱发转录模式重构并促使菌体进入脂质积累期的重要原因。在菌体生长期，高山被孢霉生物量迅速提高且大量消耗氮源与氧气；当培养基中氮源耗尽后，菌体生长速度趋于平缓，胞内开始大量积累脂质。因此，依据氮限制诱导脂质积累的特点对产油微生物进行代谢调节是强化其产脂能力的重要方向，然而如何将氮信号与基因表达进行
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种响应氮饥饿信号的自诱导启动子，该启动子能够实现产油微生物中营养(氮)信号对基因表达的精准调控，通过对基因表达进行定向启动，依据氮限制诱导脂质积累的特点对产油微生物进行代谢调节并强化其产脂能力。
2、本专利技术提供了一种响应氮饥饿信号的自诱导启动子，所述的启动子为以下(a)-(c)任一所示：
3、(a)由seq id no.1所示的核苷酸序列组成的启动子；
4、(b)将(a)中seq id no.1所示的核苷酸序列反向互补排列仍具有启动基因表达功能的启动子，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、(c)将(a)或(b)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个碱基得到的具有响应氮饥饿信号的由(a)或(b)衍生的启动子。
6、本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述启动子。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pbig2-ura5s-its载体，所述pbig2-ura5s-its载体记载于公开号为cn103571762a的专利申请文本中。
8、本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞携带上述启动子或上述重组质粒。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞包括但不限于酵母，如酿酒酵母、毕赤酵母；霉菌，如高山被孢霉；细菌，如大肠杆菌或根癌农杆菌。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞优选为高山被孢霉。
11、本专利技术还提供了一种脂质生产方法，所述方法包括以下步骤：
12、(a)将上述重组细胞接种于含铵态氮的培养基中培养；
13、(b)随着步骤(a)培养基中的铵态氮被消耗，启动重组细胞中目的基因的表达，促进脂质生产。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述脂质包括但不限于磷脂、甘油三酯、游离脂肪酸、二十碳四烯酸(ara)或二十碳五烯酸(epa)脂质。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述培养为在温度为12～28℃、转速为150～250rpm的条件下培养7～12d。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因为脂肪酸脱饱和酶基因oppfads17，所述基因oppfads17记录在公开号为cn105647822a的专利申请文本中。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因为编码细胞自噬相关基因，通过启动细胞自噬，提升脂质产量。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述编码细胞自噬相关基因为maatg8基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基为broth培养基或kendrick培养基。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述broth培养基配方包括：10-50g/l葡萄糖、1-10g/l酵母提取物、0.5-2g/l磷酸二氢钾、0.1-0.5g/l七水硫酸镁、5-15g/l硝酸钾，优选为20-30g/l葡萄糖、5g/l酵母提取物、1g/l磷酸二氢钾、0.25g/l七水硫酸镁、10g/l硝酸钾。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述kendrick培养基配方包括：20-50g/l葡萄糖、1-3g/l酒石酸铵、1-3g/l酵母提取物、5-10g/l磷酸氢二钾、1-3g/l磷酸二氢钾、1-3g/l七水硫酸镁、0.001-0.01g/l二水氯化钙以及微量元素；其中，微量元素包括：0.0001-0.001g/l七水氯化铁、0.00001-0.0001g/l七水硫酸锌、0.00001-0.0001g/l五水硫酸铜、0.00001-0.0001g/l硝酸钴、0.00001-0.0001g/l五水硫酸锰，优选为：30g/l葡萄糖、2.0g/l酒石酸铵、1.5g/l酵母提取物、7g/l磷酸氢二钾、2.0g/l磷酸二氢钾、1.5g/l七水硫酸镁、0.008g/l二水氯化钙以及微量元素；其中，微量元素为：0.001g/l七水氯化铁、0.0001g/l七水硫酸锌、0.0001g/l五水硫酸铜、0.0001g/l硝酸钴、0.0001g/l五水硫酸锰。
22、在本专利技术的一种实施方式中，所述氮源为铵态氮，如酒石酸铵、乙酸铵，或硝态氮，如硝酸钾。
23、本专利技术还提供了上述启动子，或上述重组质粒，或重组细胞在应答氮信号并定向调节下游基因转录中的应用。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述应用为将上述重组细胞接种于含铵态氮源的发酵培养基中，培养，随着培养基中铵态氮源被消耗，启动下游基因转录。
25、在本专利技术的一种实施方式中，所述含铵态氮源中的铵态氮可以选自常规铵盐，如酒石酸铵、乙酸铵。
26、有益效果：
27、(1)本专利技术提供了一种能够响应氮饥饿信号的自诱导启动子pnr和pnt，该启动子能够在培养基氮源种类或含量发生改变时，自诱导启动下游基因转录，在铵态氮耗尽后二者的转录水平分别提高到铵态氮源存在时的4.51倍与4.53倍，且发酵末期二者转录水平分别为铵态氮源存在时的3.51倍与6.42倍。
28、(2)以外源ω-3脂肪酸脱饱和酶oppfads17为报告基因，启动子pnr及pnt在培养前期铵态氮源充足时处于惰性状态，其启动oppf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种响应氮饥饿信号的自诱导启动子，其特征在于，所述的启动子为以下(a)-(c)任一所示：
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求1所述的启动子。
3.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞以酿酒酵母、毕赤酵母、大肠杆菌、根癌农杆菌或高山被孢霉为宿主。
5.一种脂质生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的基因为脂肪酸脱饱和酶基因oPpFADS17。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的基因为Maatg8基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为12～28℃。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的脂质包括磷脂、甘油三酯、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。
10.权利要求1所述启动子，或权利要求2所述重组质
...【技术特征摘要】
1.一种响应氮饥饿信号的自诱导启动子，其特征在于，所述的启动子为以下(a)-(c)任一所示：
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求1所述的启动子。
3.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞以酿酒酵母、毕赤酵母、大肠杆菌、根癌农杆菌或高山被孢霉为宿主。
5.一种脂质生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，常璐璐，俞瑞麟，杨波，赵建新，陈卫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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