【技术实现步骤摘要】
本申请是一种新型的抗体纯化工具。它是一种结合了对蛋白酶具有抗性的小肽分子，且易于生产并具有低成本和抗性的树脂，以及含有这些树脂而不含有用于纯化抗体的蛋白a-连接树脂的色谱柱，以及含有这些树脂的柱，蛋白a-连接树脂在使用过程中易于破坏、难以生产且具有高成本。本申请可以在生物学和化学的内进行评价。
技术介绍
1、抗体是由免疫系统细胞产生的分子，与传染性病原体和癌症细胞产生的分子(抗原)结合，清除这些分子并保护身体。由于每种抗体都靶向一种特定的分子，它在杀死致病细胞而不伤害其他细胞方面发挥着重要作用。近年来，抗体已被用于治疗许多疾病，主要是癌症和自身免疫性疾病。在这种方法中，也被称为免疫疗法，只在致病细胞中发现的分子被靶向。这种分子被纯化，并获得将形成针对它的抗体的细胞。然后，这些细胞通过与骨髓瘤(癌症)细胞融合而永生。从这些细胞中选择产生最佳抗体的细胞，然后将其大量培养，获得抗体。由于这些细胞来源于单个细胞，因此它们产生的抗体被称为单克隆抗体。近年来，单克隆抗体形式的生物药物占据了世界制药市场的很大份额。单克隆抗体除了用于治疗外，还用于诊断疾病，用于免疫测试，如elisa、免疫色谱分析和免疫荧光显微镜。
2、单克隆抗体生产中最重要的步骤之一是细胞培养物中产生的抗体的纯化步骤。为此，使用在葡萄球菌中发现的一种称为“蛋白a”的分子，该分子结合来自其恒定片段的抗体(fc-“恒定片段”-)(cn113512099a一种葡萄球菌蛋白a、纯化制备方法及其应用)。通过重组dna技术生产蛋白a后，将其与树脂结合，并填充到装有该树脂的过滤
3、纯化抗体最有效的方法是用蛋白a进行亲和色谱法。然而，蛋白a有显著的缺点。用重组dna技术生产蛋白a、纯化蛋白a并将其结合到树脂上是一项本身需要大量努力和费用的工作(cn102323379a一种重组蛋白a及其编码基因和用途)。因此，蛋白a柱是单克隆抗体生产中最重要的费用项目之一。第二个重要问题是，在蛋白a的抗体纯化过程中，产生这些抗体的细胞中的蛋白酶会分解蛋白a并使其失活。因此，用蛋白a制备的纯化树脂和含有它们的色谱柱在短时间内变得不可用。
4、还开发了其他色谱法来纯化抗体而不使用蛋白a。例如，基于电荷纯化分子的离子交换树脂已用于此目的(us2016115195a1单克隆抗体的纯化方法，wo2016162950a1 igm抗体的分离和纯化方法)。然而，用这种方法很难从抗体中分离出具有类似电荷的其他分子。基于疏水基团的抗体纯化不能通过结合富含疏水基团的其他蛋白质来对抗体进行特异性纯化(usre41595e抗体纯化)。使用的另一种方法是通过硫醇连接树脂分离抗体。抗体的结构中有许多二硫键。当这些键与巯基相遇时，抗体附着并固定在这些基团上(https://www.takarabio.com/products/protein-research/purification-product s/antibodypurification/thiophilic-resin)。然而，这里也遇到了另一个问题。因为许多其他可以形成二硫键的蛋白质或分子也可以附着在带有巯基的树脂上。由于这个原因，携带巯基的树脂不能像蛋白a树脂那样分离抗体。还描述了使用上述几种色谱方法的组合的纯化方法(us2011251374a1抗体纯化方法)。然而，这种方法使操作更加复杂、困难和昂贵。
技术实现思路
1、本申请包括一种树脂、色谱柱和使用这些树脂和色谱柱的抗体纯化方法，树脂与有效结合抗体的小的合成蛋白酶抗性肽结合，而不是与蛋白a结合，树脂放置在色谱柱中。为此，首先，通过固相肽合成来合成与抗体的fc部分结合的肽，然后，将它们结合到树脂上，并将它们填充到具有过滤器的色谱柱中，过滤器将树脂保持在其下。当含有由细胞产生并分泌到培养基中的抗体的液体或细胞裂解物通过该柱时，抗体通过肽与树脂结合。用洗涤液彻底洗涤树脂，然后，含有将抗体与肽分离的物质如盐、尿素和甘氨酸的溶液通过柱，抗体从树脂中洗脱并从柱中出来。通过这种方式，抗体通过将它们与混合物中的所有其他分子分离来纯化。以类似的方式，在使用蛋白a的抗体纯化中，蛋白a包被的树脂和填充它们的色谱柱在短时间内变得失活，因为来自细胞裂解物的蛋白酶降解蛋白a。然而，由于本申请开发的蛋白酶抗性抗体结合肽不受蛋白酶的影响，抗体纯化可以用它们所附着的树脂重复进行。附着在色谱柱上的抗体从柱上脱离后，可以再次装载细胞培养超流体或细胞裂解物，并且可以通过与柱结合来分离其中的抗体，并且这个过程可以重复几十次。在本申请的研究中，已经确定，尽管在树脂上放置了强蛋白酶(如蛋白酶k)，但抗体结合肽保持完整，并以相同的方式继续发挥其功能。制备对蛋白酶具有抗性的肽可以通过从d-氨基酸而不是l-氨基酸合成肽来实现。此外，已经确定，为了使肽完全对蛋白酶有抗性，肽中的所有氨基酸可以是d形式，或者依次交替为d和l形式。
2、固相肽合成是通过使用迄今为止描述的方法将氨基酸依次添加到结合在树脂上的氨基酸中来进行的。在肽的合成完成后，将肽从树脂中分离并纯化。肽分子本身可能在该分离(切割)过程中受损(us5510460a肽过程，us10683325b2固相肽合成的方法和系统)。当这些肽在亲和色谱法中用作配体时，它们必须与树脂重新连接。为了消除这些困难，在本申请中，开发了在抗体纯化中使用在其上直接进行肽合成的树脂的方法。在该方法中，在树脂上合成蛋白酶抗性肽后，对其进行洗涤以去除合成中使用的化学物质残留，并且树脂准备用于抗体纯化。因此，不需要将肽从一种树脂中分离出来并将其连接到另一种树脂上。
3、尽管先前已经制备了蛋白酶抗性肽配体(us10266566b2蛋白酶抗性肽配体)，但是迄今为止还没有制备使用蛋白酶抗性肽的抗体结合树脂并将其用于抗体纯化。
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1.一种具有蛋白酶抗性肽分子的树脂，在含有抗体的液体中，所述肽分子与所述抗体结合，且所述肽分子能够使得所述抗体与其他分子分离。
2.根据权利要求1所述的树脂，在所述树脂上合成所述蛋白酶抗性肽分子后，所述树脂能够被直接用于抗体纯化，而不需要将所述蛋白酶抗性肽分子与所述树脂分离，并且也不需要将所述蛋白酶抗性肽分子与其他树脂结合。
3.根据权利要求1所述的树脂，所述蛋白酶抗性肽分子全部用D形式的氨基酸合成，或者由依次交替的一个D形式和一个L形式的氨基酸合成。
4.一种用于抗体纯化的亲和色谱柱，其填充有如权利要求1所述的树脂。
【技术特征摘要】
1.一种具有蛋白酶抗性肽分子的树脂，在含有抗体的液体中，所述肽分子与所述抗体结合，且所述肽分子能够使得所述抗体与其他分子分离。
2.根据权利要求1所述的树脂，在所述树脂上合成所述蛋白酶抗性肽分子后，所述树脂能够被直接用于抗体纯化，而不需要将所述蛋白酶抗性肽分子与所述树...
【专利技术属性】
技术研发人员：祖图·塔尼勒·科卡戈斯，奥兹格·卡恩，
申请(专利权)人：生物技术科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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