【技术实现步骤摘要】
本申请涉及体外诊断医学检验领域，尤其是一种类固醇激素阴性血清的制备方法，以及制备类固醇激素阴性血清的试剂盒。
技术介绍
1、类固醇激素，又称甾体激素，是由胆固醇经一系列酶催化代谢产生的一类脂溶性小分子激素，结构上属于环戊烷多氢菲衍生物。根据功能性质，一般将其分为肾上腺皮质激素和性激素两大类。类固醇激素通过内分泌系统调节人体新陈代谢，同时，其对生长、发育、生殖及维持人体内环境稳定等方面起着重要的调节作用。类固醇激素紊乱会导致多种疾病的发生，包括先天性肾上腺皮质增生症(cah)，醛固酮增多症(pa)、库欣综合征(cs)、多囊卵巢综合征(pcos)、性早熟等。因此，检测血液中类固醇激素的浓度对健康检测以及这些疾病的辅助诊断具有重要意义。
2、类固醇激素在人体内水平低，目前检测方法有传统的免疫分析法、气相色谱-质谱法(gc-ms)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)。免疫分析法特异性差，容易出现交叉反应，而且一次只能检测一种类固醇激素。相比于传统的免疫法，gc-ms法特异性好，可同时检测多种类固醇激素，但样品的提取、纯化和衍生步骤比较繁琐，使其在临床广泛开展难度很大。lc-ms/ms法除了低检测限、高灵敏度、高特异性以及一次进样即可同时定量检测多种类固醇激素的优势外，还具有不用衍生、样品配制简单的优势。
3、在检测血清样本中的类固醇激素时，血清中除了类固醇激素外还会存在蛋白等其他基质，这些基质往往会影响类固醇激素的定量结果，特别是在lc-ms/ms灵敏度高，待测类固醇激素浓度低的情况下，微小影响也可能导致较大
技术实现思路
1、为了最大化的保证液相色谱串联质谱法定量检测血清中类固醇激素结果的准确性，常需要配制阴性血清，通过阴性血清来配制对照品，进而构建校正曲线或标准曲线，这样可以使对照品溶液和待测样本溶液的基质环境基本一致，从而使外标定量的结果更准确。这里的阴性血清是指经处理后含有少量或几乎不含有待测类固醇激素的血清。血清成分复杂，如何去除血清中的类固醇激素同时不破坏血清基质的生物特性是类固醇激素阴性血清制备过程面临的一大难题。
2、针对上述问题，本申请提供了一种类固醇激素阴性血清的制备方法，类固醇激素阴性血清制备用试剂盒，类固醇激素阴性血清，类固醇激素阴性血清的检测方法及检测用试剂盒。
3、一种类固醇激素阴性血清的制备方法。
4、该方法包括：
5、步骤一：在血清中加入萃取试剂，混匀后静置或离心，取下层血清1；
6、步骤二：向所述下层血清1中加入甲基叔丁基醚，混匀后静置或离心，取下层血清2；
7、其中，所述萃取试剂包括甲基叔丁基醚和正丁醇。
8、在一些实施方式中，所述方法还包括：控制步骤一操作过程的温度在22℃及以下；优选为10℃～22℃；优选为15℃～22℃。
9、在一些实施方式中，所述萃取试剂中甲基叔丁基醚和正丁醇的体积比为3～10:1；优选为3～8:1；优选为3～6:1；优选为4～5:1；优选为5:1。
10、在一些实施方式中，所述方法还包括：取下层血清1或下层血清2置于紫外灯下进行照射。
11、优选地，所述紫外灯的功率为30w-150w。
12、优选地，所述紫外灯的功率为100w-150w。
13、优选地，所述下层血清1或下层血清2与所述紫外灯光源的距离为10cm-50cm。
14、优选地，所述紫外灯的照射时间为6h～24h。
15、优选地，所述萃取试剂与血清的体积比为1:3至1:1；优选为1:2～1:1；优选为1:2。
16、其中，所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和皮质醇中的一种或多种。
17、一种用于制备类固醇激素阴性血清的试剂盒。
18、所述试剂盒用于上述类固醇激素阴性血清的制备方法。
19、所述试剂盒包括：萃取试剂，该萃取试剂包含甲基叔丁基醚和正丁醇；其中，甲基叔丁基醚和正丁醇的体积比为3～10:1；优选为3～8:1；优选为3～6:1；优选为4～5:1；优选为5:1；
20、所述试剂盒还包括：甲基叔丁基醚；
21、所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和皮质醇中的一种或多种。
22、一种用于类固醇激素检测的阴性血清。
23、所述阴性血清通过上述的类固醇激素阴性血清的制备方法获得。该阴性血清不含有或几乎不含有待测类固醇激素，所述阴性血清中类固醇激素的含量低于普通血清的99％；
24、所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和皮质醇中的一种或多种。
25、一种检测血清中类固醇激素的方法。
26、所述方法使用上述的阴性血清进行类固醇激素的检测。
27、所述方法具体包括：
28、a.标准品的配制：向所述阴性血清中加入一种或多种待测的类固醇激素；
29、b.将步骤a获得的类固醇激素标准品溶液进行浓度梯度稀释，获得多个浓度的稀释液；以及
30、c.测量所述多个浓度的稀释液中的类固醇激素的浓度，使用针对所述多个浓度的稀释液的测量结果获得标准曲线，利用标准曲线计算待测样品的类固醇激素的浓度。
31、在一些实施方式中，液相质谱联用仪检测时的液相条件包括：采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱。
32、在本申请的一个实施方式中，液相条件为：流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸甲醇溶液；采用全氟苯基柱；色谱柱温度：50℃；
33、梯度洗脱程序如下表2。
34、同时质谱条件如下表3和表4。
35、在该液相质谱联用仪条件下可以在较短的时间内(6.5min)实现10种类固醇激素的色谱分离和检测，且该条件下的质谱具有更高的灵敏度，能同时进行血液中10种类固醇激素的定量分析。
36、在一些实施方式中，所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和皮质醇中的一种或多种。
37、一种用于lc-ms/ms检测血清中类固醇激素的试剂盒。
38、萃取试剂，该萃取试剂包含甲基叔丁基醚和正丁醇；其中，甲基叔丁基醚和正丁醇的体积比为3～10:1；优选为3～8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类固醇激素阴性血清的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：控制步骤一操作过程的温度在22℃及以下；优选为10℃～22℃；优选为15℃～22℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取试剂中甲基叔丁基醚和正丁醇的体积比为3～10:1；优选为3～8:1；优选为3～6:1；优选为4～5:1；优选为5:1。
4.根据权利要求1至3之一所述的方法，所述方法还包括：取下层血清1或下层血清2置于紫外灯下进行照射。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述紫外灯的功率为30W-150W；
6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中，所述萃取试剂与血清的体积比为1:3至1:1；优选为1:2～1:1；优选为1:2。
7.根据权利要求1至6之一所述的方法，其中，所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和
8.一种用于制备类固醇激素阴性血清的试剂盒，所述试剂盒用于权利要求1至7之一所述的类固醇激素阴性血清的制备方法；所述试剂盒包括：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内标；优选地，所述内标含有同位素标记的待测类固醇激素。
10.一种阴性血清，所述阴性血清通过权利要求1至7之一所述的方法制备获得。
11.根据权利要求10所述的阴性血清，其中，所述阴性血清中类固醇激素的含量低于普通血清的1％；
12.一种检测血清中类固醇激素的方法，所述方法使用权利要求1至7之一所述的方法获得的类固醇激素的阴性血清，具体包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中，液相串联质谱检测时的液相条件包括：采样流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液；
14.一种用于权利要求12所述的检测血清中类固醇激素方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内标液，该内标液含有同位素标记的待测类固醇激素；
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括沉淀剂；
...【技术特征摘要】
1.一种类固醇激素阴性血清的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：控制步骤一操作过程的温度在22℃及以下；优选为10℃～22℃；优选为15℃～22℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取试剂中甲基叔丁基醚和正丁醇的体积比为3～10:1；优选为3～8:1；优选为3～6:1；优选为4～5:1；优选为5:1。
4.根据权利要求1至3之一所述的方法，所述方法还包括：取下层血清1或下层血清2置于紫外灯下进行照射。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述紫外灯的功率为30w-150w；
6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中，所述萃取试剂与血清的体积比为1:3至1:1；优选为1:2～1:1；优选为1:2。
7.根据权利要求1至6之一所述的方法，其中，所述类固醇激素包括雄烯二酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、17-羟孕烯醇酮、皮质素、皮质醇、睾酮中的一种或多种；优选地，所述类固醇激素包括17-羟孕酮、皮质酮、皮质素和皮质醇中的一种或多种。
8.一种用于制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐敏强，李伟，任建洪，
申请(专利权)人：苏州帕诺米克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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