【技术实现步骤摘要】
本披露涉及外源核苷酸基因定点整合的细胞系，制备方法及其用途；更具体地，涉及一种通过在nfat5基因插入识别标签或外源基因而获得的宿主细胞。
技术介绍
1、传统构建外源蛋白表达细胞系的方法是将外源基因随机插入到细胞基因组中。由于插入位点的随机性、插入基因拷贝数的随机性，使得稳转细胞表现出不同的生长特性、表达特性，且在长期传代的过程中存在拷贝数丢失等的风险。在构建外源蛋白高表达细胞系时需要对候选细胞系表达产物的表达量检测，对不同质量参数检测，并对细胞进行长期稳定性传代最终筛选出可长期稳定高表达且产物质量参数合格的生产用细胞株。基于随机整合方法获得的重组细胞展现出了巨大的单克隆差异性，因此需要花费很长的时间及人力物力成本，用于挑选出最终可以应用于生产的单克隆细胞。
2、中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,cho)，作为生物制药细胞系开发领域中最重要的生产细胞系，已经被广泛应用于治疗性蛋白质的表达中，包括重组抗体、重组单体蛋白及重组融合蛋白等。
3、定点整合技术，可以将外源基因精确整合到cho基因组内的稳定高表达位点，极大降低了所获得重组细胞的单克隆多样性，简化了单克隆筛选流程，从而降低了生物制药开发的时间与人力物力成本。为了能实现外源基因的定点整合，最重要的是找到cho细胞系基因组内可以稳定高表达外源基因的位点。
4、目前已有一些制药企业公开了cho细胞基因组内可用于表达外源基因的位点，如辉瑞公司(wo2013190032)报道的一处位于fer1l4基因31到32
技术实现思路
1、本披露提供了一种包含整合在特定位点处的外源核苷酸序列的宿主细胞，其中所述的特定位点为nfat5基因。
2、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为nfat5基因的内含子；优选地，所述的特定位点为nfat5基因的第1内含子(nw_003614572.1(269232--293783))。
3、在一些实施方案中，如前任一项所述的宿主细胞，其中所述的特定位点包含如序列seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的核苷酸序列，或与seq id no:2、seq idno:3或seq id no:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
4、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为如序列seq idno:2所示的核苷酸序列。
5、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为如序列seq idno:3所示的核苷酸序列。
6、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括至少2个重组识别序列，位于编码目标序列的基因的侧翼。
7、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述重组识别序列包含了可被酪氨酸重组酶识别的位点如frt位点或lox位点；或可被丝氨酸重组酶识别的序列如att位点。
8、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述重组识别序列是frt位点或lox位点。
9、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，所述重组识别序列选自以下各项组成的群组：loxp位点、lox511位点、lox2272位点、lox2372位点、lox5171位点、loxm2位点、lox71位点、lox66位点、loxfas位点、attp位点、attb位点、野生型frt位点、frt3位点和frt5位点。
10、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，所述重组识别序列为loxp和lox2272位点。
11、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因。
12、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物，可检测的蛋白，和抗体或其抗原可结合片段的基因。
13、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述筛选标记物基因是抗性基因，所述的可检测的蛋白是荧光标记蛋白。
14、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞，其中所述筛选标记物选自gs选择标记物、dhfr选择标记物、遗传霉素选择标记物、新霉素选择标记物、嘌呤霉素选择标记物或胸苷激酶选择标记物；
15、最优选的，其中所述筛选标记物是新霉素选择标记物，所述的可检测的蛋白是绿荧光标记蛋白。
16、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个抗体或其抗原可结合片段。
17、在一些实施方案中，如前所述的宿主细胞是小鼠细胞、人类细胞、cho细胞株、chok1细胞株、cho-s细胞株、cho-dxb11或cho-dg44细胞株，优选cho细胞株。
18、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列的包含3′端同源臂和5′端同源臂；所述的3′端同源臂与nfat5基因第1内含子、seq id no:2或seq id no:3的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与nfat5基因第1内含子、seq idno:2或seq id no:3的核苷酸序列中所存在的序列同源。
19、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述的3′端同源臂与seq id no:32的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与seq id no:31的核苷酸序列中所存在的序列同源。
20、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述的3′端同源臂与seq id no:34的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与seq id no:33的核苷酸序列中所存在的序列同源。
21、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列选自：
22、a).所述外源核苷酸序列包括2个同源臂，所述的同源臂为与seq id no:32的核苷酸序列中所存在的序列同源的3′端同源臂，和与seq id no:31的核苷酸序列中所存在的序列同源的5′端同源臂，
23、两个重组识别序列loxp和lox 2272位点，
24、启动子，筛选标记物基因和/或抗性基因；或
25、b).所述外源核苷酸序列包括2个同源臂，所述的同源臂为与seq id no:34的核苷酸序列中所存在的序列同源的3′端同源臂，和与seq id no:33的核苷酸序列中所存在的序列同源所述的5′端同源臂，
26、两个重组识别序列loxp和lox 2272位点，
27、启动子，抗体或其抗原可结合片段的基因。
28、在一些实施方案中，如前所述宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含整合在特定位点处的外源核苷酸序列的宿主细胞，其中所述的特定位点为Nfat5基因。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为Nfat5基因的内含子；优选地，所述的特定位点为Nfat5基因的第1内含子。
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述的特定位点包含如序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括至少2个重组识别序列，位于编码目标序列的基因的侧翼；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因；
6.根据权利要求1-5中任一项所述宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个抗体或其抗原可结合片段
7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是小鼠细胞、人类细胞、CHO细胞株、CHO-K1细胞株、CHO-S细胞株、CHO-DXB11或CHO-DG44细胞株，优选CHO细胞株。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列的包含3′端同源臂和5′端同源臂；所述的3′端同源臂与Nfat5基因的第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与Nfat5基因的第1内含子、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源；
9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列选自：
10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括选自如下所示的c)、d)和e)：
11.一种表达目标产物的宿主细胞的构建方法，所述方法包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因；优选地，包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因的内含子中；更优选地，包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因的第1内含子中。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因；
13.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，包括：
14.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，包括：
15.根据权利要求14所述的宿主细胞的构建方法，其中所述的3′端同源臂与Nfat5基因第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与Nfat5基因第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源；
...【技术特征摘要】
1.一种包含整合在特定位点处的外源核苷酸序列的宿主细胞，其中所述的特定位点为nfat5基因。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为nfat5基因的内含子；优选地，所述的特定位点为nfat5基因的第1内含子。
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述的特定位点包含如序列seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的核苷酸序列，或与seq id no:2、seq id no:3或seq idno:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括至少2个重组识别序列，位于编码目标序列的基因的侧翼；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因；
6.根据权利要求1-5中任一项所述宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个抗体或其抗原可结合片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是小鼠细胞、人类细胞、cho细胞株、cho-k1细胞株、cho-s细胞株、cho-dxb11或cho-dg44细胞株，优选cho细胞株。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列的包含3′端同源臂和5′端同源臂；所述的3′端同源臂与nfat5基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：周松涛，岳丽云，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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