【技术实现步骤摘要】
本申请涉及分子生物学，尤其是一种化橘红品种鉴别的分子标记及鉴定方法。
技术介绍
1、化州柚(citrusgrandis‘tomentosa’)属芸香科，其未成熟或近成熟的干燥外层果皮为名贵中药材——化橘红。化橘红是岭南八大道地药材和十大广药之一，具有理气宽中，燥湿化痰的功效。化橘红因其良好的医疗保健作用，已被广泛用于中医临床治病防病，需求量逐年增长，其质量优劣将直接影响治疗效果及社会经济效益。不同品系的化橘红，药效成分的含量差异较大。但市场上化橘红暂时没有以不同品系分类进行售卖，只是简单以形状、表面金色绒毛的多少、香味和光泽进行分类，因此容易出现“以次充好”和“药效不足”等问题。
2、目前，化橘红种植栽培上有黄龙，凤尾，副毛，西洋，密叶正毛及密叶红肉这几个品系，密叶正毛和密叶红肉化橘红之间差异小，仅有果肉颜色的区别，该两种品系一般统称为密叶类化橘红。传统的品种鉴定以植物外观进行分类，即以根、茎、叶、花等植物部位的形状、颜色和气味等进行辨别。由于化橘红各品系之间遗传背景几乎相近，外观形状很相似，单纯用传统方法很难区分化橘红不同品系。此外，植物的表型还受到环境、树龄和人为因素等多重影响，增加了用传统分类学方法辨识化橘红的难度。
3、indel是指基于等位基因位点在近缘种或不同个体之间发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，因而产生了长度多态性变异。indel分子标记则是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行pcr扩增的标记，可以比较pcr产物的大小来区分不同个体。遗传具有稳定性，相比于传统的植物分类学，在
技术实现思路
1、本申请的目的在于，克服运用传统植物分类学对不同品系化橘红辨别难的问题，提供了一种化橘红品种鉴别的分子标记及鉴定方法。
2、为实现上述目的，本申请采用如下技术方案：
3、本申请的第一目的，提供了一种化橘红品种鉴别的indel分子标记引物组，所述indel分子标记引物组的核苷酸序列如seq id no：1～2所示。
4、本申请基于密叶类化橘红相对于其他品系，在1，2rhat基因启动子上游1345bp和1389bp处，有两段长度分别为18和363bp的dna插入片段，在该两段插入片段的两端选取各品系1,2rhat启动子相同序列处设计本申请的indel分子标记引物，pcr后再进行凝胶电泳，即可将密叶类化橘红和其他品系化橘红准确地区分开来。
5、本申请的第二目的，提供了一种化橘红品种鉴别的indel分子标记，其特征在于，所述indel分子标记由上述indel分子标记引物组经扩增密叶类化橘红基因组dna得到。
6、将化橘红各品系1，2rhat启动子序列在dnaman软件上比对，分析得出各品系1，2rhat启动子可分为两类，黄龙、西洋、凤尾、副毛四个品系序列一致归为一类，密叶正毛和密叶红肉两个品系序列一致归为一类；密叶正毛和密叶红肉两个品系相对于其他品系，在1,2rhat基因启动子上游1345和1389bp处，有两段长度分别为18和363bp的dna插入片段，即为本申请的indel分子标记。化橘红各品系之间外观性状较为相似，用肉眼很难分辨各种品系，而本申请的indel分子标记具有准确性高、简单快速、直观明了和稳定性好等优点，能够很好的解决化橘红品系区分的问题。
7、本申请的第三目的，提供了上述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用。
8、作为本申请所述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用的优选实施方式，提取密叶类化橘红的基因组dna，用上述indel分子标记引物组对待测化橘红样品的基因组dna进行pcr扩增，获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，即可鉴别出密叶类化橘红和其他品系化橘红，若出现843bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为密叶类化橘红；若出现452bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为其他品系化橘红。
9、作为本申请所述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用的优选实施方式，所述pcr扩增的反应体系包括以下：2×taq master mix(dye plus)5μl，10μmol/l如上述的indel分子标记引物组0.8μl，模板1μl，无菌水3.2μl，共10μl。
10、作为本申请所述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用的优选实施方式，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒、54℃退火15秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃彻底延伸7分钟。
11、作为本申请所述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用的优选实施方式，所述密叶类化橘红包括密叶正毛化橘红和密叶红肉化橘红。
12、作为本申请所述indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用的优选实施方式，所述密叶类化橘红相对其他品系化橘红，在1，2rhat基因启动子上游1345bp和1389bp处，有两段长度分别为18bp和363bp的dna插入片段，所述dna插入片段的核苷酸序列如seqid no：3～4所示。
13、与现有技术相比，本申请的有益效果是：
14、本申请提供了基于不同品系化州柚1,2rhat基因启动子序列中，密叶类(密叶正毛和密叶红肉)品系化橘红相较于黄龙等品系存在两个插入片段，开发了检测密叶类化橘红和其他品系化橘红的indel分子标记引物组和鉴定方法。该indel分子标记引物组通过普通pcr和琼脂糖凝胶电泳技术即可快速、特异、灵敏、简便的区分出密叶化橘红和其他化橘红品系，可应用于密叶类化橘红与其他品系化橘红之间的鉴定。
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1.一种化橘红品种鉴别的InDel分子标记引物组，其特征在于，所述InDel分子标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。
2.一种化橘红品种鉴别的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记由如权利要求1所述的InDel分子标记引物组经扩增密叶类化橘红基因组DNA得到。
3.如权利要求2所述的InDel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，提取密叶类化橘红的基因组DNA，用如权利要求1所述InDel分子标记引物组对待测化橘红样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，即可鉴别出密叶类化橘红和其他品系化橘红，若出现843bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为密叶类化橘红；若出现452bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为其他品系化橘红。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括以下：2×TaqMaster Mix(Dye Plus)5μL，10μmol/L如权利要求1所述的InDel分子标记引物组0.8μL，模板1
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒、54℃退火15秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃彻底延伸7分钟。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述密叶类化橘红包括密叶正毛化橘红和密叶红肉化橘红。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述密叶类化橘红相对其他品系化橘红，在1，2RhaT基因启动子上游1345bp和1389bp处，有两段长度分别为18bp和363bp的DNA插入片段，所述DNA插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。
...【技术特征摘要】
1.一种化橘红品种鉴别的indel分子标记引物组，其特征在于，所述indel分子标记引物组的核苷酸序列如seq id no：1～2所示。
2.一种化橘红品种鉴别的indel分子标记，其特征在于，所述indel分子标记由如权利要求1所述的indel分子标记引物组经扩增密叶类化橘红基因组dna得到。
3.如权利要求2所述的indel分子标记在化橘红品种鉴别育种中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，提取密叶类化橘红的基因组dna，用如权利要求1所述indel分子标记引物组对待测化橘红样品的基因组dna进行pcr扩增，获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，即可鉴别出密叶类化橘红和其他品系化橘红，若出现843bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为密叶类化橘红；若出现452bp长度的单一条带，则待测化橘红样品为其他品系化橘红。
5.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈立凯，詹若挺，陈浪，庄洁璇，刘军民，刘子琪，谢黎黎，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：
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