【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒、肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，属于电化学生物传感器。
技术介绍
1、电化学传感技术具有高灵敏、响应快、准确度高的优点，在生物检测、环境监控、食品安全等领域得到了广泛的应用。其中，适配体传感器以适配体作为识别元件，能够以高亲和性和特异性识别目标物，相较于抗体具备更好的稳定性、毒性且易于储存。
2、癌症是当今严重威胁人类生命的最主要疾病之一，实现肿瘤的早期诊断对降低癌症患者死亡率具有重要意义。其中，肿瘤标志物是临床中常用于癌症诊断的判断依据之一。外泌体(exosomes)作为近年来新兴的肿瘤标志物，是一种可以经由绝大多数细胞分泌的脂质双层膜囊泡，其直径为30-150nm。外泌体广泛分布于人体的血液、唾液、尿液和脑脊液等多种体液中，携带着衍生细胞的多种物质信息，如蛋白、mrna、脂质等，能够在细胞间进行信息传递，影响细胞的生理状态并反映来源细胞的性质。通过对外泌体进行检测与分析对肿瘤的早期诊断、疗效评价以及预后分析具有重要的研究意义。因此，开发一种能够精准定量外泌体的检测方法是目前的研究热点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种能够提高外泌体定量检测准确度的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒。
2、本专利技术的目的还在于提供一种肿瘤细胞外泌体的定量检测方法。
3、为了实现以上目的，本专利技术的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒所采用的技术方案是：
4、一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，包
5、本专利技术的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，外泌体捕获电极以及信号放大探针中的fe3o4纳米粒子和mxene纳米片的大比表面积和高导电性有利于外泌体的捕获和电信号响应的增强。该用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒在捕获和检测外泌体时能够进一步放大传感信号，形成一种双重放大电信号的三明治结构的适配体传感器，实现外泌体高灵敏、高稳定的检测。
6、本专利技术的电化学传感器在外泌体检测中的检测限可低至43个/μl，检测范围可达102-107个/μl，并且可以通过双蛋白标记实现对4t1、hela、hepg2和a549四种肿瘤细胞的识别。
7、可以理解的是，所述信号放大探针是将靶向第二外泌体特异标志蛋白的核酸适配体锚定在第二材料上形成。
8、进一步地，所述第一材料为第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子，所述第二材料为第二化学基团修饰的mxene纳米片。将第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子作为第一材料，能够以其大比表面积捕获外泌体，尤其采用基底电极为磁性基底电极时，fe3o4纳米粒子能够依靠磁性性直接结合组装于基底电极表面简化组装过程，并减少其后续修饰转移过程中的材料掉落和损耗现象，增大电化学信号，提高灵敏度；将第二化学基团修饰的mxene纳米片作为第二材料，能够依靠其优良地电化学性能放大电化学信号，实现更为灵敏的检测。
9、进一步地，所述第一化学基团为氨基或羧基，所述第二化学基团为氨基或羧基，且第一化学基团与第二化学基团不同。
10、进一步地，所述基底电极为磁性基底电极。以第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子作为第一材料时，fe3o4纳米粒子的磁性吸附作用可以直接实现其与基底电极的直接连接，增大捕获效率并提高传感器的检测性能。所述磁性基底电极优选为磁性玻碳电极。
11、所述第一外泌体特异标志性蛋白为cd63蛋白；第二外泌体特异标志性蛋白为epcam蛋白。分别以cd63蛋白和epcam蛋白作为第一外泌体特异标志性蛋白和第二外泌体特异标志性蛋白的原因在于cd63蛋白和epcam蛋白作为普遍在各类外泌体表面表达的蛋白被广泛应用在外泌体于适配体的特异性连接之中。
12、进一步地，所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子为氨基化修饰的fe3o4纳米粒子。所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白(即cd63蛋白)的核酸适配体为5′-cooh-ttttttcaccccacctcgctcccgtgacactaatgcta。氨基化修饰的fe3o4纳米粒子通过锚定靶向cd63蛋白适配体后作为纳米捕获探针，可以与外泌体连接，起到捕获外泌体和电信号放大的作用。
13、所述基底电极为磁性基底电极，第一材料为第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子时，进一步地，所述的外泌体捕获电极的制备方法，包括以下步骤：将磁性基底电极浸没于第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液中与靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液孵育一段时间后，混入edc/nhs混合溶液进行孵育。所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液的浓度为1-2mg/ml。所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液的浓度为1-1.5μmol/l。所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液与所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液的体积之比为1:1-2:1。所述fe3o4纳米粒子溶液中与靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液孵育优选时间为30-45min。靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液与混入的edc/nhs混合溶液的体积之比为1.5～2.5:1。混入edc/nhs混合溶液后孵育时间为过夜。混入edc/nhs混合溶液后进行孵育的温度为4℃。
14、进一步地，所述edc/nhs混合溶液中edc和nhs的浓度摩尔比例为2:3。所述edc/nhs混合溶液中edc的浓度为0.4mol/l，nhs的浓度为0.6mol/l。
15、进一步地，所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将fe3o4纳米粒子分散在醇类溶剂中加入氨基硅烷偶联剂在75-85℃下进行反应，反应结束后将反应产物进行洗涤、干燥，即得。所述氨基硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷。加入氨基硅烷偶联剂在75-85℃下进行反应的时间为24-26h，反应在搅拌条件下进行。优选地，加入氨基硅烷偶联剂在80℃下进行反应。每0.2g fe3o4纳米粒子对应采用的氨基硅烷偶联剂的质量为0.4-0.5ml。所述醇类溶剂优选为乙醇，每0.2g fe3o4纳米粒子对应采用的醇类溶剂的体积为90～110ml，例如为100ml。
16、所述fe3o4纳米粒子的平均粒径为180～220nm，例如为200nm。所述fe3o4纳米粒子可以采用溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：包括外泌体捕获电极；所述外泌体捕获电极包括基底电极、修饰在基底电极上的第一材料以及锚定在第一材料上的靶向第一外泌体特异性标志性蛋白的核酸适配体；
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一材料为第一化学基团修饰的Fe3O4纳米粒子，所述第二材料为第二化学基团修饰的MXene纳米片。
3.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一化学基团为氨基或羧基，所述第二化学基团为氨基或羧基，且第一化学基团与第二化学基团不同。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一外泌体特异标志性蛋白为CD63蛋白；第二外泌体特异标志性蛋白为EpCAM蛋白。
5.根据权利要求4所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一化学基团修饰的Fe3O4纳米粒子为氨基化修饰的Fe3O4纳米粒子；所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体为5′-COOH-TTTTTTCACCCCACCTCGC
6.根据权利要求4所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第二化学基团修饰的MXene纳米片为羧基化修饰的MXene纳米片；所述靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体为5′-NH2-TTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG。
7.根据权利要求6所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述羧基化修饰的MXene纳米片是将分层MXene纳米片悬浮液加入到氨基酸溶液中进行反应后干燥得到。
8.根据权利要求1～3中任意一项所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一化学基团修饰的Fe3O4纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将Fe3O4纳米粒子分散在醇类溶剂中加入氨基硅烷偶联剂在75-85℃下进行反应，反应结束后将反应产物进行洗涤、干燥，即得。
9.根据权利要求1～3中任意一项所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述基底电极为磁性基底电极。
10.一种肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：包括外泌体捕获电极；所述外泌体捕获电极包括基底电极、修饰在基底电极上的第一材料以及锚定在第一材料上的靶向第一外泌体特异性标志性蛋白的核酸适配体；
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一材料为第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子，所述第二材料为第二化学基团修饰的mxene纳米片。
3.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一化学基团为氨基或羧基，所述第二化学基团为氨基或羧基，且第一化学基团与第二化学基团不同。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一外泌体特异标志性蛋白为cd63蛋白；第二外泌体特异标志性蛋白为epcam蛋白。
5.根据权利要求4所述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，其特征在于：所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子为氨基化修饰的fe3o4纳米粒子；所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体为5′-cooh-ttttttcaccccacctcgctcccgtgaca...
【专利技术属性】
技术研发人员：董文飞，庄琳琳，尤倩楠，梅茜，葛明锋，常智敏，李力，
申请(专利权)人：郑州中科生物医学工程技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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