【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业，具体涉及一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用。
技术介绍
1、加州新小绥螨人工培养的检验实际操作中，一般分为飘浮法、直检法、分离法等。
2、飘浮法的操作步骤包括：将1g待测样品放在盛有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内，然后加30ml饱和食盐水至容器的三分之二处，搅拌均匀，吸取100ul待检液体放置在10倍放大镜或双筒实体显微镜下检视，并估算100ul待检液中螨虫的数量，从而计算出待测样品中的螨虫数量。
3、直检法的具体检测方法为：取a4纸放置在桌面上，用200目的网筛将1g待测样品筛选至a4纸上，在纸上筛15-20次；将a4纸上混有螨虫和麦麸粉的混合物轻敲转移至隔水平台的薄膜上，并迅速将a4纸上残留的少量螨虫用小毛笔挑出至筛出的a4纸上；在隔水平台薄膜上用小毛笔挑出肉眼可看到的爬动的螨虫，在检视镜下计算得到每1g麦麸混合物中螨虫的大约头数。
4、分离法的具体检测方法为：称取1g待测样品，旁边放置一新鲜配制的固体琼脂培养基，16小时后在显微镜下估算吸引到培养基上的螨虫数量。或者利用螨虫的趋光性，在1g待测样品旁放置一漏斗，在漏斗开口处放60-100w的日光电灯泡，用漏斗反向收集螨虫，两小时后用显微镜检测估算螨虫数量。
5、目前，各种常用的加州新小绥螨的数量检测方法都是建立在显微镜估算的基础上，只是螨虫取样的方法各有不同。但由于活螨的活动轨迹不可控制，极其容易导致漏检，从而使最后的计算结果偏小。而且检测方法时间长、操作繁琐、效率低
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，底物(vra-nag)液配制方式为：vra-nag、蔗糖、乙二醇、edta-na2、聚乙烯吡咯烷酮、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液。具体的配制方法如下：
2、
3、由于底物(vra-nag)可测nag酶活性，在实际应用时可利用底物vra-nag和加州新小绥螨体内的nag酶反应的酶解产物在碱性条件下呈红色的生物化学原理，间接计算加州新小绥螨的虫体密度，从而估算出生物农药螨虫虫体的密度，进而代替人工镜下数数的繁琐，解放眼睛。由于计算所得包括待测样品中的死螨，所以有可能会导致结果比实际值偏高，最后数据要加系数校正。本专利技术所述的检测方法快速、简便、效率高，相较于传统的计数方法省人力、省工时，还能保证数据准确性。
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，实际应用包括以下步骤：
5、取样：在产品出厂前，在加州新小绥螨饲养室依据取样规则随机选择盛放加州新小绥螨培养基的培养盆,将盆中麦麸混匀后,即为样品，重复抽取3份，每份1g。
6、裂解：在加州新小绥螨及其培养基中加入1ml样品处理液，充分混匀1-2分钟。
7、酶解：取上述样品处理液1ml，加入300ul底物反应液，充分混匀后静置反应15分钟。
8、显色：取200ul酶解充分的反应液，加200ul显色反应液。
9、产品虫体密度计算：检测结果应在3分钟内与对应标准曲线以估算加州新小绥螨的数量，或者测反应液505nm处的od值以计算出螨虫数量，进而推断这个批次的产品虫体密度符不符合出厂要求。
10、优选的，所述样品处理时样品处理液的配制方法为：buffer用ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液，试剂包括0.01％-1％的p40、0.01％-0.1％的聚乙烯吡咯烷酮、0.01％-0.1％的bsa、0.5％-3％的蔗糖、0.01％-0.1％的防腐剂proclin300等。
11、优选的，所述酶解时底物反应液的配制方法为：buffer用ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液，试剂包括0.01％-0.1％的vra-nag、0.5％-5％的蔗糖、0.15％-1.5％的乙二醇、0.01％-0.05％的edta-na2、0.01％-0.15％的聚乙烯吡咯烷酮、0.01％-0.1％的防腐剂proclin300等。
12、优选的，所述显色时显色反应液的配制方法为：buffer用2％的氢氧化钠溶液，另外加0.1％-1％的tween-20和0.01％-0.1％的防腐剂proclin300等。
13、优选的，所述计算参考色卡或标准曲线是提前用标准品反复测量定标的，标准品浓度为7只/ml、20只/ml、100只/ml、500只/ml、1500只/ml，若检测结果超出色卡最深色或od值高于2.8，则建议稀释后复测。
14、本专利技术提供了一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，底物(vra-nag)配制可以应用在加州新小绥螨nag酶活性检测上，从而替代现行的人工计数法间接对加州新小绥螨进行虫体数量的检测，可以更高效、更便捷、更快速的估算出加州新小绥螨的产品虫体数量，进而确定该产品虫体密度是否符合出厂要求。
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1.一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，所说底物(VRA-NAG)可检测加州新小绥螨的NAG酶活并为其体内的NAG酶定量，从而间接推算加州新小绥螨的数量已达到替代显微镜镜下计数的目的。
2.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所说检测NAG酶活性的底物(VRA-NAG)液配制方式为：VRA-NAG、蔗糖、乙二醇、EDTA-Na2、聚乙烯吡咯烷酮、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为PH4.6的10mM柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所说底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中的应用涉及一些检测试剂，包括：样品处理液、底物反应液、显色反应液。
4.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所说底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中应用时，检测试剂中具有螨虫样品处
5.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所述底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中应用时，检测试剂中NAG酶酶解VRA-NAG的底物反应液包括：VRA-NAG、蔗糖、乙二醇、EDTA-Na2、聚乙烯吡咯烷酮、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为PH4.6的10mM柠檬酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所说底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中应用时，检测试剂中让酶解游离出的VRA显色物的显色液包括：Tween-20和防腐剂等混合而成，其中缓冲液为2％的氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所述底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中应用的检测方法包括以下几个步骤：
8.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于：所述底物(VRA-NAG)在加州新小绥螨NAG酶活性检测中应用时的检测结果在3分钟内需与比色卡对应以估算加州新小绥螨的数量，或者3分钟内测反应液505nm处的OD值以计算出螨虫数量，进而推断这个批次的产品螨虫密度符不符合出厂要求。
9.根据权利要求2、4、5所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，缓冲液为PH4.6的10mM柠檬酸缓冲液，配制方式为：9.2ml 100mM碳酸钠溶液、10.8ml 100mM碳酸氢钠溶液混合，再用超纯水稀释10倍而成。
10.根据权利要求6所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，强碱性条件下，酶解游离出的VRA遇碱显红色，因此，配制显色液时缓冲液应选择2％的氢氧化钠溶液。
11.根据权利要求2、4、5、6所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，防腐剂是指添加此类物质后可以有效抑制检测试剂中的微生物生长繁殖，从而防止溶液中有效成分被微生物降解。常用的防腐剂一般有硫柳汞、叠氮化钠、麝香草酚、Proclin300等，可以搭配其中的一种或二种以上的组合，至少使用一种，本专利技术最优选使用Proclin300，其组成为0.01-0.1％。
12.根据权利要求2、4、5、6所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，包括样品处理液、底物反应液、显色反应液在内的检测试剂应于常温避光保存，为防止试剂分层或变质，不得冷藏或冻存。
13.根据权利要求7所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，检测时间短、敏感性高、操作简便、效率高，对操作质检人员技能水平要求低，而且检验过程对质检人员身体健康基本无影响。
14.根据权利要求8所述的一种加州新小绥螨NAG酶活性检测的底物(VRA-NAG)配制及其应用，其特征在于，显色反应最好在3分钟内判读，时间最长不要超过1个小时。因为显色反应会随着反应时间的延长而加深，从而导致计算结果偏高，影响判断。...
【技术特征摘要】
1.一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于，所说底物(vra-nag)可检测加州新小绥螨的nag酶活并为其体内的nag酶定量，从而间接推算加州新小绥螨的数量已达到替代显微镜镜下计数的目的。
2.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所说检测nag酶活性的底物(vra-nag)液配制方式为：vra-nag、蔗糖、乙二醇、edta-na2、聚乙烯吡咯烷酮、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所说底物(vra-nag)在加州新小绥螨nag酶活性检测中的应用涉及一些检测试剂，包括：样品处理液、底物反应液、显色反应液。
4.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所说底物(vra-nag)在加州新小绥螨nag酶活性检测中应用时，检测试剂中具有螨虫样品处理液包括：p40、聚乙烯吡咯烷酮、bsa、蔗糖、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所述底物(vra-nag)在加州新小绥螨nag酶活性检测中应用时，检测试剂中nag酶酶解vra-nag的底物反应液包括：vra-nag、蔗糖、乙二醇、edta-na2、聚乙烯吡咯烷酮、防腐剂等混合制备而成，其中缓冲液为ph4.6的10mm柠檬酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所说底物(vra-nag)在加州新小绥螨nag酶活性检测中应用时，检测试剂中让酶解游离出的vra显色物的显色液包括：tween-20和防腐剂等混合而成，其中缓冲液为2％的氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-nag)配制及其应用，其特征在于：所述底物(vra-nag)在加州新小绥螨nag酶活性检测中应用的检测方法包括以下几个步骤：
8.根据权利要求1所述的一种加州新小绥螨nag酶活性检测的底物(vra-na...
【专利技术属性】
技术研发人员：郜安国，黄云坚，谭卓，
申请(专利权)人：安徽弘济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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