【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及核酸构建体、表达载体、表达系统、及其应用。
技术介绍
1、自第一个基因工程药品在1982年问市以来，生物药物在全球医药产业中的市场比重一直持续快速增长。通常每年都会有20多种新产品获得fda批准，而且其中大部分是重组蛋白药物(包括重组抗体)。全球生物制药的市场销售额在2018年就已高达2372亿美元，预计到2024年将升至3890亿美元。目前生产重组蛋白首选的表达系统通常是哺乳动物细胞表达系统。这是因为对于某些需要特定的翻译后修饰(如糖基化)的复杂大分子蛋白，只有在哺乳动物细胞表达系统中才能正确形成。其中，近89％的单克隆抗体药物是在cho细胞中生产的。
2、近年来，通过对细胞系改造、无血清悬浮培养基的成分优化、上下游生产工艺优化和载体改造等方面的研究，cho细胞系统生产重组蛋白的能力不断增强，已能够达到10g/l的产量。其中，高效表达载体的构建对重组蛋白的表达水平和产品质量具有重要影响。既能够有效地缩短细胞系开发的时间，同时又能显著提高蛋白产量。研究表明，通过对表达载体上的启动子等调控元件进行改造，可以有效提高转基因表达水平。
3、能够介导基因正确转录起始的启动子区域，是载体优化的研究热点之一。启动子上含有多种转录因子结合位点和增强子等顺式作用元件，对重组蛋白表达具有重要作用。在工业生产中，现有的商业化载体大多是由人巨细胞病毒主要直接早期基因(humancytomegalovirus major immediate early gene，hcmv mie)启动子及其衍生物
4、真核生物的内含子参与转录调控，其中部分序列还表现出类似于增强子的作用。内含子具有增强rna聚合酶ii的处理能力、促进剪接蛋白与某些转录因子和/或蛋白质之间的相互作用、以及通过连接和促进多种类型的rna加工等多种作用机制。已有研究证明，cmv启动子的活性通过其下游内含子a的存在而进一步增强。因此，针对性对hcmv启动子，及其内含子a元件进行优化改进，能够为重组蛋白高效表达载体构建的提供高可行性且普适性的解决方案。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种核酸构建体，能够作为表达载体的启动子元件，用于构建重组蛋白表达载体和表达系统，提高目的蛋白稳定表达水平。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种表达载体，以本专利技术提供的核酸构建体作为启动子元件，用于构建重组蛋白表达系统，提高目的蛋白稳定表达水平。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种重组蛋白表达系统，具有高的稳定表达水平。
4、本专利技术的目的之四在于提供本专利技术表达系统再制备重组蛋白试剂方面的应用。
5、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
6、核酸构建体，包括hcmv立即早期启动子的增强子序列、rna聚合酶ii启动子序列、第一个外显子序列和内含子a序列；不包括hcmv立即早期启动子的上游调控序列和核因子1结合位点簇序列。
7、可选的，所述增强子序列包括spl(ccgccc)、cre/atf(tgacgtca)和nf-κb(gggactttcc)转录因子调控序列。
8、可选的，所述上游调控序列和核因子1结合位点簇序列如seq id no：1所示。
9、进一步优选的，与如seq id no：1所示核酸构建体不同之处在于，内含子a序列替换为如seq id no：3、seq id no：4或seq id no：5所示。
10、一种表达载体，包括上述核酸构建体；所述核酸构建体作为表达载体的启动子功能元件。
11、可选的，上述表达载体以pcmv-egfp、pcmv-seap或pcmv-has为出发载体，敲除出发载体如seq id no：1所示的cmv启动子的上游调控序列和核因子1结合位点簇序列；
12、和/或替换内含子a序列为如seq id no：3、seq id no：4或seq id no：5所示。
13、进一步的，所述表达载体还包括目的蛋白表达盒。
14、一种表达系统，包括将上述表达载体转染至哺乳动物细胞构建而成。
15、可选的，所述哺乳动物细胞选自cho、hek293、bhk21、cos-7中的任意一种；优选为cho细胞。
16、本专利技术提供的上述表达系统可以用于制备包含目的蛋白的制剂；所述制剂选自蛋白检测试剂、治疗或预防疾病的目的蛋白药物、带有目的蛋白的基因药物。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术提供一种核酸构建体，不包括hcmv mie启动子中的上游调控序列和核因子1结合位点簇序列，作为表达载体的启动子元件，构建重组蛋白表达载体和表达系统，提高重组蛋白稳定表达水平1.4～4倍；
19、另外，本专利技术优化内含子a序列，替换本专利技术提供核酸构建体形成的截短启动子的内含子a序列，与包括完整hcmv mie启动子序列的出发载体构建的cho表达系统比较，能够提高重组蛋白稳定表达水平；并且优选如seq id no：3所述的内含子a序列，与包含本专利技术提供的核酸构建体作为截短启动子的表达载体构建的cho表达系统比较，能够更进一步提高重组蛋白稳定表达水平。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.核酸构建体，其特征在于，包括hCMV立即早期启动子的增强子序列、RNA聚合酶II启动子序列、第一个外显子序列和内含子A序列；不包括hCMV立即早期启动子的上游调控序列和核因子1结合位点簇序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述增强子序列包括Spl(CCGCCC)、CRE/ATF(TGACGTCA)和NF-κB(GGGACTTTCC)转录因子调控序列。
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，上游调控序列和核因子1结合位点簇序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述内含子A序列如SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示；
5.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的核酸构建体；所述核酸构建体作为表达载体的启动子功能元件。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，以pCMV-EGFP、pCMV-SEAP或pCMV-HAS为出发载体，敲除出发载体如SEQ ID NO：1所示的CMV启动子的上游调
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括目的蛋白表达盒。
8.一种表达系统，其特征在于，包括将如权利要求5～7任一项所述表达载体转染至哺乳动物细胞构建而成。
9.如权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自CHO、HEK293、BHK21、COS-7中的任意一种；优选为CHO细胞。
10.如权利要求7～8所述表达系统的应用，其特征在于，用于制备包含目的蛋白的制剂；
...【技术特征摘要】
1.核酸构建体，其特征在于，包括hcmv立即早期启动子的增强子序列、rna聚合酶ii启动子序列、第一个外显子序列和内含子a序列；不包括hcmv立即早期启动子的上游调控序列和核因子1结合位点簇序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述增强子序列包括spl(ccgccc)、cre/atf(tgacgtca)和nf-κb(gggactttcc)转录因子调控序列。
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，上游调控序列和核因子1结合位点簇序列如seq id no：1所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述内含子a序列如seq idno：3、seq id no：4或seq id no：5所示；
5.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1～4任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，郭潇，赵俊玲，徐婷婷，林艳，张玺，孙秋丽，赵春澎，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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