【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种糖基水解酶及其编码基因、载体、宿主细胞和应用。
技术介绍
1、人参皂苷是人参属植物中最具代表性的活性成分，由于苷元结构和糖链上糖的种类、个数及连接位置的不同，人参皂苷类成分结构丰富多样，如人参皂苷ra、rb1、rb2、rb3、rc、rd、re、rf、rg1等。药理研究表明，这些人参皂苷类成分具有延缓衰老、神经保护、提高免疫力、抑制肿瘤细胞生长等活性。但因多数人参皂苷类成分结构中含有多个糖基，分子量较大，不易被人体吸收，在人体内的肠道菌群作用下结构中的糖基发生部分水解，转化为分子量相对小的稀有人参皂苷，如rg3、rh2、rh3、rk2等，这类成分水溶性、脂溶性均会增高，药理活性变强，在抗肿瘤方面更是表现出优势活性。
2、有研究者在研究人参皂苷与抗肿瘤活性的构效关系时发现，随着糖基数量的减少，不同类型的人参皂苷的活性表现为：单糖苷>双糖苷>三糖苷>四糖苷。
3、然而，结构中含糖基相对少的稀有人参皂苷在人参属植物中含量非常低，单纯从植物中提取制备，不仅生产成本极高，而且对植物资源消耗巨大，利用化学水解的方法制备这些稀有人参皂苷，也涉及到选择性差，容易破坏苷元结构等问题。生物法，尤其是生物酶法，可以在温和的条件下，选择性地对特定的糖苷键进行水解，进而实现稀有人参皂苷的绿色、高效制备，低成本获得稀有人参皂苷。糖基水解酶是催化上述反应的一类酶，目前利用糖基水解酶制备特定的稀有人参皂苷的方法也受到关注。
4、cn102762738a公开了一种人参皂苷糖苷酶及其用途，该糖苷
5、cn108064309a公开了一种酶催化合成人参皂苷rh2的方法，该方法以人参皂苷rg3为底物加入特定的葡萄糖苷酶进行催化反应，水解掉第20位的葡萄糖生成人参皂苷rh2。
6、虽然目前已有利用微生物来源的糖苷水解酶来制备稀有人参皂苷的报道，但特异且通用型地水解原人参二醇(ppd)型皂苷3位碳糖链上β-1,2-葡萄糖苷键的糖基水解酶尚无任何报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的一个目的在于提供一种用于选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基的糖基水解酶，该糖基水解酶的催化位点具有特异性，其可以选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基。
2、本专利技术的另一个目的在于提供一种编码上述糖基水解酶的核苷酸序列。
3、本专利技术的再一个目的在于提供一种含有上述核苷酸序列的重组表达载体。
4、本专利技术的又一个目的在于提供一种含有核苷酸序列或重组表达载体的宿主细胞。
5、本专利技术的又一个目的在于提供一种如上所述的糖基水解酶、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体和如上所述的重组宿主细胞中的任一项在选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基方面的应用。
6、本专利技术采用如下技术方案实现上述目的。
7、一方面，本专利技术提供了一种用于选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基的糖基水解酶，所述糖基水解酶为(a)或(b)：
8、(a)氨基酸序列如seq id no:1所示的糖基水解酶；
9、(b)seq id no:1所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的由(a)衍生的糖基水解酶。
10、本专利技术还提供了一种糖基水解酶，所述糖基水解酶来自人参属植物，且为如上所述的糖基水解酶的同源氨基酸序列。
11、根据本专利技术所述的糖基水解酶，优选地，所述糖基水解酶与根据如(a)或(b)所述的糖基水解酶具有至少80％的相似度。
12、根据本专利技术所述的糖基水解酶，优选地，所述糖基水解酶如下任一所述：
13、(c)氨基酸序列如seq id no:4所示的糖基水解酶；
14、(d)seq id no:4所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的由(c)衍生的糖基水解酶；
15、(e)氨基酸序列如seq id no:6所示的糖基水解酶；
16、(f)seq id no:6所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的由(e)衍生的糖基水解酶。
17、另一方面，本专利技术提供了一种编码上述糖基水解酶的核苷酸序列。
18、根据本专利技术的核苷酸序列，优选地，编码(a)所述糖基水解酶的核苷酸序列如seqid no:2所示；编码(c)所述糖基水解酶的核苷酸序列如seq id no:3所示；编码(e)所述糖基水解酶的核苷酸序列如seq id no:5所示。
19、再一方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述核苷酸序列。
20、根据本专利技术的重组表达载体，优选地，所使用的表达载体为pet32a。
21、又一方面，本专利技术提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有上述核苷酸序列或上述重组表达载体。
22、根据本专利技术的重组宿主细胞，优选地，所使用的宿主细胞选自细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞或动物细胞。
23、又一方面，本专利技术提供了一种如上所述的糖基水解酶、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体和如上所述的重组宿主细胞中的任一项在选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基方面的应用。
24、根据本专利技术的应用，优选地，所述ppd型人参皂苷包括三七皂苷r4、人参皂苷ra1、人参皂苷ra2、人参皂苷ra3、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3、人参皂苷rc、人参皂苷rd、人参皂苷rg3。
25、根据本专利技术的应用，优选地，所述ppd型人参皂苷为带有第3位碳上β-1,2-葡萄糖基的达玛烷型人参皂苷混合物。
26、本专利技术从人参属多种植物中均分离得到了能够选择性地水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基的具有同源序列的糖基水解酶。从三七中分离得到了糖基水解酶(seqid no:1)，代号为pngh1；从人参中分离得到了糖基水解酶(seq id no:4)，代号为pggh1；从西洋参中分离得到了糖基水解酶(seq id no:6)，代号为pqgh1。本专利技术发现，188、232、425位的谷氨酸为pngh1选择性水解所述葡萄糖基的关键位点，其中425位的谷氨酸尤为重要。本专利技术还公开了用于编码上述氨基酸序列的优化后的核苷酸序列，分别为seq id no:2、seq id no:3和seq id no:5。
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1.一种用于选择性水解PPD型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶为(a)或(b)：
2.一种糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶来自人参属植物，且为权利要求1所述的糖基水解酶的同源氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶与根据权利要求1所述的糖基水解酶具有至少80％的相似度。
4.根据权利要求3所述的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶如下任一所述：
5.编码权利要求1～4任一项所述的糖基水解酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于，编码(a)所述糖基水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码(c)所述糖基水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码(e)所述糖基水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求5或6所述的核苷酸序列。
8.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求5所述的核苷酸序列或含
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其特征在于，所使用的宿主细胞选自细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞或动物细胞。
10.权利要求1～4任一项所述的糖基水解酶、权利要求5或6所述的核苷酸序列、权利要求7所述的重组表达载体和权利要求8或9所述的重组宿主细胞中的任一项在选择性水解PPD型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于选择性水解ppd型人参皂苷的第3位碳上的葡萄糖基的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶为(a)或(b)：
2.一种糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶来自人参属植物，且为权利要求1所述的糖基水解酶的同源氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶与根据权利要求1所述的糖基水解酶具有至少80％的相似度。
4.根据权利要求3所述的糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶如下任一所述：
5.编码权利要求1～4任一项所述的糖基水解酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于，编码(a)所述糖基水解酶的核苷酸序列如seq id no:2所示；编码(c)所述糖基水解酶的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：史社坡，刘晓，万建波，罗源，张蓓蓓，王娟，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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